呂揚歌 吳凌智

嘉興市第一醫(yī)院（嘉興學(xué)院附屬醫(yī)院）藥學(xué)部，浙江嘉興 314000

據(jù)統(tǒng)計，阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）患者中，絕經(jīng)期女性的發(fā)病率約為同年齡段男性的3 倍[1]，且其發(fā)病率與絕經(jīng)后雌激素水平相關(guān)[2]。雌激素替代治療可顯著減少AD 患者大腦β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積，減輕神經(jīng)元炎性反應(yīng)和凋亡，對患者的認知功能也有顯著改善作用[3,4]。然而，雌激素在治療認知功能障礙的同時，也會增加乳腺、子宮、卵巢等腫瘤發(fā)病的風險[5,6]。雌激素的功能主要通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）介導(dǎo)，ER 有兩種亞型：ERα 和ERβ，其中ERα 大量分布于子宮、卵巢等生殖器官，當與雌激素結(jié)合后，極易引發(fā)相關(guān)腫瘤[7,8]。2000 年，F(xiàn)ilardo 等[9]發(fā)現(xiàn)一種新的G 蛋白耦聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPR）可被17β 雌二醇結(jié)合，并發(fā)揮快速非基因組效應(yīng)，該受體被命名為GPR30。GPR30 廣泛表達于多種細胞，獨立介導(dǎo)雌激素的非基因組效應(yīng)的特點使其成為可避免雌激素治療引起腫瘤風險、同時發(fā)揮認知功能改善作用的潛在靶點。cAMP 效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一種在神經(jīng)細胞內(nèi)廣泛表達的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)元生長發(fā)育、神經(jīng)突觸形成及細胞修復(fù)等神經(jīng)生理活動中起關(guān)鍵作用，其被激活后可調(diào)節(jié)下游基因如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及凋亡相關(guān)基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3 等）的表達[10,11]。研究證實，雌激素可激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路并進一步激活CREB，而這一作用在無ER 的細胞系中也同樣存在[12]，鑒于此，筆者推測GPR30 可通過上述信號通路影響AD 的病理過程，給予GPR30激動劑G1 可能通過與GPR30 受體結(jié)合，從而激活CREB/BDNF 通路影響神經(jīng)元凋亡、再生功能，從而發(fā)揮抗AD 作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性SPF 級ICR 小鼠由南京青龍山動物飼養(yǎng)廠提供，體質(zhì)量22～24g，小鼠可自由獲取水和食物。將ICR 小鼠飼養(yǎng)到6 月齡后，按照體質(zhì)量進行隨機分組，分為對照組、模型組、陽性對照組、G1 低劑量組、G1 中劑量組、G1 高劑量組，每組各12 只。本研究經(jīng)嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準[倫理審批編號：JUMC2020-013；動物實驗許可證編號：SYXK（浙）2020-007]。

1.2 主要試劑

Caspase-3、Bcl-2、Bax、CREB、p-CREB、BDNF抗體及山羊抗兔二抗購自美國Affinity Biosciences公司，G1 購自美國MedChemExpress 公司，Aβ1-42購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 動物模型的建立

將ICR 小鼠用水合氯醛（17.5mg/ml）麻醉后固定在立體定位儀上，坐標為距前囟2.0mm、距中線1.5mm、深度 2.0mm。將含有或不含有 Aβ1-42（410pmol/小鼠）的磷酸鹽緩沖鹽水（5μl）注射到雙側(cè)海馬體中（每側(cè)2.5μl，輸注速度1μl/min），輸注完畢后留針2min。

1.4 動物給藥

造模結(jié)束48h 后，ICR 小鼠每日給予相應(yīng)藥物或溶劑（0.5%羥甲基纖維素鈉），連續(xù)給藥4 周。藥物均使用0.5%羥甲基纖維素鈉配制成混懸劑，現(xiàn)用現(xiàn)配。給藥劑量：陽性對照組灌胃給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg；G1 低、中、高劑量組分別腹腔注射給予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg 的GPR30 激動劑G1；對照組和模型組給予等體積的溶劑。

1.5 行為學(xué)實驗

1.5.1 Morris 水迷宮實驗 整個實驗分為三個階段：①可見平臺訓(xùn)練期為期2d：逃生平臺固定放置于某處水面以下1cm，并在平臺旁豎一面小旗標（高5cm）。小鼠每日進行4 次實驗，每次實驗間隔1h。當小鼠到達逃生平臺時實驗結(jié)束，記錄小鼠到達逃生平臺所需時間（逃避潛伏期）。若小鼠在90s 內(nèi)未能找到平臺則測試結(jié)束，并引導(dǎo)小鼠置于平臺30s。②隱藏平臺訓(xùn)練期為期3d：訓(xùn)練過程中，取下旗幟，其余同可見平臺訓(xùn)練期。③第6 天為空間探索實驗：撤去逃生平臺，開始探索實驗。小鼠從任一象限開始，面朝池壁放入水中，統(tǒng)計小鼠90s 內(nèi)在平臺目標象限停留時間百分比和穿越原平臺位置次數(shù)。

1.5.2 避暗實驗 Morris 水迷宮實驗結(jié)束后間隔24h 進行避暗實驗。實驗分為2 天，第1 天為訓(xùn)練期，將小鼠腹朝拱門放入明箱，關(guān)閉箱底交流電讓小鼠適應(yīng)環(huán)境2min，然后打開暗箱底部交流電，重新將小鼠腹朝拱門放入明箱，記錄5min 內(nèi)小鼠的逃避潛伏期和錯誤次數(shù)，作為訓(xùn)練成績；第2 天為測試期，再次將小鼠腹朝拱門放入明箱，記錄5min 內(nèi)小鼠的逃避潛伏期和錯誤次數(shù)，作為測試成績。若5min 內(nèi)小鼠未進入暗箱，則逃避潛伏期記為300s，錯誤次數(shù)記為0 次。

1.5.3 新物體識別實驗 實驗過程分為適應(yīng)期、熟悉期和測試期。在第1 天適應(yīng)期時，每組小鼠均依次放入曠場箱中適應(yīng)5min。第2 天熟悉期則需將兩個相同的物體分別放入曠場箱的左右兩側(cè)，每組小鼠于箱中適應(yīng)5min。第3 天為測試期，將第2 天放入曠場箱中2 個相同物體的其中一個更換為新物體后，將小鼠放入曠場箱中進行測試。統(tǒng)計小鼠對熟悉物體A 及新物體B 的探索時間EA、EB，計算小鼠的識別指數(shù)（discrimination index，DI），DI=（EB-EA）/（EA+EB）。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測

小鼠脫頸處死后迅速提取海馬組織樣本，提取蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、caspase-3、BDNF、CREB、p-CREB 的表達水平，分析GPR30 對神經(jīng)元凋亡和再生的調(diào)節(jié)作用及機制。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPR30 激動劑可改善Aβ1-42小鼠認知功能障礙

Morris 水迷宮實驗中，小鼠在可見平臺測試第1天中表現(xiàn)出相似的逃避潛伏期，表明給予Aβ1-42或G1對小鼠的視力或基礎(chǔ)動力無顯著影響（P＞0.05），見圖1A。隱藏平臺訓(xùn)練期數(shù)據(jù)顯示，各組小鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，訓(xùn)練期第5 天，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著長于對照組（P＜0.001），G1 中、高劑量組小鼠的逃避潛伏期均顯著短于模型組（P＜0.05），見圖1A。在空間探索實驗中，與對照組相比，模型組小鼠的目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數(shù)顯著降低（P＜0.05）；G1 高劑量組小鼠上述兩個指標均顯著高于模型組（P＜0.05），見圖1B、圖1C。

避暗實驗中，對照組小鼠的錯誤次數(shù)顯著少于模型組（P＜0.001），避暗潛伏期顯著長于模型組（P＜0.01）；G1 中、高劑量組小鼠的錯誤次數(shù)均顯著少于模型組（P＜0.05），避暗潛伏期均顯著長于模型組（P＜0.05），見圖1D、圖1E。

新物體識別實驗中，模型組小鼠的DI 顯著低于對照組（P＜0.01）；G1 中、高劑量組小鼠的DI 均顯著高于模型組（P＜0.05），見圖1F。

圖1 GPR30 激動劑對Aβ1-42誘導(dǎo)的小鼠認知功能障礙的作用

2.2 GPR30 激動劑抑制Aβ1-42小鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的表達

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中的Bcl-2/Bax 比例降低，活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例升高（P＜0.001）；G1 高劑量組小鼠海馬組織中的Bcl-2/Bax 比例顯著高于模型組（P＜0.05），G1 中、高劑量組小鼠活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例均顯著低于模型組（P＜0.05），見圖2。

圖2 GPR30 激動劑對小鼠海馬組織中caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達水平的影響

2.3 GPR30 激動劑增加 Aβ1-42 小鼠海馬組織中p-CREB/CREB 和mBDNF/proBDNF 的比例

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中的p-CREB/CREB 水平顯著低于對照組（P＜0.01）；G1 高劑量組小鼠海馬組織中的p-CREB/CREB 水平顯著高于模型組（P＜0.05）。模型組小鼠海馬組織中的 mBDNF/proBDNF 的比例顯著低于對照組（P＜0.001），G1 高劑量組小鼠海馬組織中的mBDNF/proBDNF 的比例顯著高于模型組（P＜0.05），見圖3。

圖3 GPR30 激動劑對小鼠海馬組織中CREB 和BDNF 表達水平的影響

3 討論

AD 的病因復(fù)雜多樣，目前還未能得出統(tǒng)一結(jié)論，但AD 患者的神經(jīng)病理學(xué)改變幾乎完全一致，主要表現(xiàn)為腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，大腦皮層和海馬回神經(jīng)元丟失及突觸數(shù)量減少等[13-15]。在這些病理改變的基礎(chǔ)上提出一系列AD 發(fā)病機制的假說，包括Aβ 級聯(lián)假說、慢性炎癥假說、Tau 蛋白假說等[14,16]。其中Aβ 級聯(lián)假說被認為是AD 發(fā)病最關(guān)鍵的因素，受到廣泛認可[17]。Aβ 是Master 等[18]在1985 年首次從老年斑中分離出的核心成分，在正常生理條件下，Aβ 的生成和代謝處于動態(tài)平衡，但當多種因素引起Aβ 代謝平衡紊亂時，Aβ 可在大腦皮層和海馬區(qū)域出現(xiàn)異常增多和沉積，引發(fā)突觸變化、神經(jīng)元損傷、炎性反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)丟失等，最終導(dǎo)致大腦功能失調(diào)，產(chǎn)生認知功能障礙[19]。目前已證實的AD 相關(guān)高發(fā)基因的變異均與Aβ 的異常增多和沉積有關(guān)[16]。

本研究采用Aβ1-42腦室注射誘導(dǎo)產(chǎn)生小鼠AD 模型，通過行為學(xué)實驗和相關(guān)蛋白檢測研究GPR30 對AD 所致的認知功能障礙和神經(jīng)元損傷的作用。在水迷宮實驗等行為學(xué)實驗中，模型組小鼠的認知能力較對照組小鼠顯著降低，給予G1 后可顯著逆轉(zhuǎn)Aβ1-42的這一作用，提示GPR30 激動劑G1 可顯著改善Aβ1-42所致的小鼠認知功能障礙。

神經(jīng)元凋亡是AD 引起認知功能障礙的最主要原因，研究表明Aβ1-42在腦部的聚集會產(chǎn)生多種神經(jīng)毒性效應(yīng)，如神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性、鈣穩(wěn)態(tài)破壞、Tau 蛋白高度磷酸化等，導(dǎo)致AD 患者的神經(jīng)元大量丟失，最終導(dǎo)致患者的認知功能進行性下降。在AD 發(fā)生早期，即可在AD 患者大腦中觀察到Aβ 的沉積及其引起的氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細胞凋亡[20]。在此過程中，caspase-3、Bcl-2、Bax 扮演著重要的調(diào)控角色，為初步探究GPR30 激動劑對Aβ1-42所致小鼠認知功能障礙改善的潛在機制，對小鼠海馬和皮層組織中的凋亡及神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)蛋白表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，Aβ1-42可引起p-CREB/CREB、mBDNF/proBDNF、Bcl-2/Bax 降低，激活caspase-3，導(dǎo)致小鼠神經(jīng)元凋亡。而GPR30 激動劑G1 可顯著逆轉(zhuǎn)由Aβ1-42引起的這一系列凋亡和神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)蛋白的變化。

綜上所述，給予GPR30 激動劑可顯著改善AD模型鼠的認知功能，逆轉(zhuǎn)Aβ1-42所致神經(jīng)元凋亡，促進神經(jīng)元再生，這一作用的分子機制可能是通過激活CREB/BDNF 通路，進而調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-3和BDNF 的表達水平，從而發(fā)揮抗AD 作用。這些發(fā)現(xiàn)為GPR30 在Aβ1-42誘導(dǎo)的認知障礙和細胞凋亡中的作用提供了新的見解。同時也為我們進一步研究GPR30 改善AD 所致的認知功能障礙的分子機制提供了重要的實驗基礎(chǔ)和參考依據(jù)。