王佳明，鄭蹦蹦，馬勇勝

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨二科，哈爾濱 150001)

骨對(duì)機(jī)械性振動(dòng)刺激敏感，可通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)應(yīng)對(duì)不斷變化的負(fù)荷。骨細(xì)胞是骨組織中主要的機(jī)械刺激感覺(jué)細(xì)胞[1]，振動(dòng)刺激可通過(guò)激活分子信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)產(chǎn)生。骨組織在低應(yīng)力條件下由間充質(zhì)細(xì)胞生成，而間充質(zhì)細(xì)胞在高應(yīng)力條件下可形成纖維組織，在中等應(yīng)力下，間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，并啟動(dòng)軟骨性愈傷組織的形成，這一過(guò)程最初填補(bǔ)了骨折空隙[2-3]。因此，生物力學(xué)環(huán)境在骨重建和骨再生過(guò)程中對(duì)骨細(xì)胞的影響至關(guān)重要。此外，在骨植入物整合過(guò)程中，生物力學(xué)環(huán)境也起著至關(guān)重要的作用。植入物材料的表面特性及其生物力學(xué)特性是影響成骨細(xì)胞向植入物表面募集和分化的主要因素，可防止植入物的松動(dòng)。因此，開(kāi)發(fā)新型的骨科植入物材料和涂層成為研究熱點(diǎn)。目前，骨科植入物多為不銹鋼、鈦合金，其作為人體內(nèi)異物會(huì)引起局部的炎癥反應(yīng)，而鍍有二氧化鈦/鈦酸鎂(TiO2/Mg2TiO4)納米層的骨植入物能夠很好地解決植入物分層的問(wèn)題[4]，鎂合金植入引起的術(shù)區(qū)炎癥反應(yīng)程度低于其他植入物，且具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和彈性模量，故較鈦合金和不銹鋼合金更適合作為骨折手術(shù)內(nèi)植入物[5-6]。骨具有機(jī)械敏感性，低能量高頻振動(dòng)(low-magnitude high-frequency vibration，LMHFV)可促進(jìn)骨質(zhì)疏松患者的骨形成、改善其骨密度[7-8]，故認(rèn)為L(zhǎng)MHFV對(duì)于改善骨愈合和骨植入物骨整合有積極影響?，F(xiàn)就LMHFV對(duì)骨組織細(xì)胞及骨愈合的作用及機(jī)制研究進(jìn)展予以綜述。

1 LMHFV對(duì)骨組織細(xì)胞的作用

在骨折愈合過(guò)程中，LMHFV對(duì)不同骨組織細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生不同的影響。LMHFV可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)骨架重構(gòu)，從而影響MSC的增殖和分化；還可通過(guò)減少成骨細(xì)胞釋放破骨細(xì)胞介質(zhì)來(lái)直接或間接抑制破骨細(xì)胞的形成和活性。LMHFV可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)血管生成、增加骨折處的骨形成，故分析LMHFV在細(xì)胞層面上的骨愈合相關(guān)信號(hào)通路和機(jī)制有重要意義。

1.1LMHFV與骨髓MSC(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC) BMSC是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的基質(zhì)細(xì)胞[9]，存在于中軸骨或外周骨松質(zhì)骨的骨小梁中，骨髓組織中含量最多，可分化為骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪等[10]。骨折發(fā)生時(shí)，BMSC在體內(nèi)多種炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子等細(xì)胞因子作用下定向遷移、分化[11]，并在骨折部位完成歸巢及植入[12]。BMSC通過(guò)分泌表達(dá)多種細(xì)胞因子(如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白)促進(jìn)骨與軟骨的形成[13]，在骨折部位的招募過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LMHFV可在細(xì)胞水平上抑制干擾素產(chǎn)生，并可抑制自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞毒性作用[14]。

骨折發(fā)生時(shí)受損組織導(dǎo)致的局部出血和缺氧會(huì)造成炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6等炎癥因子，這些炎癥因子會(huì)刺激骨髓釋放MSC，并促進(jìn)骨折部位MSC的歸巢[15]，從而促進(jìn)骨愈合。LMHFV通過(guò)刺激基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/CXC趨化因子受體4通路促進(jìn)骨折愈合，對(duì)MSC的募集起重要作用，故血清基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1檢測(cè)可評(píng)估LMHFV對(duì)BMSC的募集作用程度[16]，從而調(diào)整LMHFV的能量和頻率參數(shù)，體現(xiàn)了LMHFV的可調(diào)節(jié)性。此外，LMHFV可通過(guò)抑制脂肪生成和促進(jìn)成骨作用來(lái)改變BMSC的譜系定型[17]，促進(jìn)BMSC增殖[18]。其中，LMHFV對(duì)BMSC的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過(guò)細(xì)胞骨架重構(gòu)機(jī)制來(lái)完成[19]。其具體過(guò)程為L(zhǎng)MHFV通過(guò)上調(diào)肌動(dòng)蛋白相關(guān)基因，并通過(guò)細(xì)胞核與細(xì)胞骨架的偶聯(lián)放大機(jī)械刺激反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。

1.2LMHFV與成骨細(xì)胞 骨的形成由成骨細(xì)胞介導(dǎo)，其中機(jī)械刺激對(duì)成骨和骨重建具有至關(guān)重要的作用。骨細(xì)胞[21]和成骨細(xì)胞[22]是機(jī)械敏感細(xì)胞，成骨細(xì)胞可受到LMHFV的影響。當(dāng)振動(dòng)范圍為0.25～0.5 g、振動(dòng)頻率為30～60 Hz時(shí)，細(xì)胞發(fā)生增殖、礦化，細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，LMHFV可增加細(xì)胞外基質(zhì)的礦化作用[23]。此外，LMHFV可加速成骨細(xì)胞的分化。LMHFV還可顯著提高血清堿性磷酸酶、骨鈣素、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白/成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體/Ⅰ型膠原蛋白和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達(dá)，而下調(diào)骨硬化蛋白(sclerosteosis，SOST)基因表達(dá)[24]，上述標(biāo)志物對(duì)骨形成和成骨細(xì)胞分化非常重要。此外，LMHFV可明顯上調(diào)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6和β聯(lián)蛋白信號(hào)通路成員Wnt3a、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6、β聯(lián)蛋白的基因表達(dá)[25]，其對(duì)成骨細(xì)胞生成均具有積極影響。

機(jī)械性振動(dòng)刺激可促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)，并降低破骨細(xì)胞的表達(dá)。外部生物力學(xué)刺激與調(diào)節(jié)MSC中肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重構(gòu)有關(guān)，Haffner-Luntzer等[26]研究表明，LMHFV可增加肌動(dòng)蛋白重構(gòu)，振動(dòng)組的微絲數(shù)量增加、應(yīng)力纖維變厚，表明振動(dòng)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞效應(yīng)可能取決于細(xì)胞骨架的重排。此外，骨組織中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)主要取決于雌激素及雌激素受體(estrogen receptor，ER)[27]，特別是LMFHV中ERα對(duì)成骨細(xì)胞的作用。環(huán)加氧酶2受LMHFV機(jī)械應(yīng)變上調(diào)，并參與成骨細(xì)胞增殖。綜上，LMHFV可通過(guò)上調(diào)與成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄、Wnt相關(guān)基因表達(dá)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6、β聯(lián)蛋白的基因表達(dá)以及細(xì)胞骨架重構(gòu)和ER通路來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化及基質(zhì)礦化，從而促進(jìn)骨愈合。

1.3LMHFV與破骨細(xì)胞 除上調(diào)成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞生成的間接作用外，LMHFV還可能直接作用于破骨細(xì)胞。這些細(xì)胞來(lái)自單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的造血譜系，對(duì)骨吸收至關(guān)重要。破骨細(xì)胞的分化和活性由核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)結(jié)合誘導(dǎo)，但該作用可被可溶的RANKL結(jié)合受體OPG減弱[28]。Wu等[29]對(duì)小鼠RAW246.7破骨細(xì)胞進(jìn)行45 Hz(0.3 g)的LMHFV處理(15 min/d)，分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)陽(yáng)性的多核細(xì)胞和破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)，結(jié)果表明，機(jī)械性振動(dòng)刺激能夠顯著下調(diào)TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞基因組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶9的生成。TRAP和組織蛋白酶具有骨骼吸收作用，基質(zhì)金屬蛋白酶9可介導(dǎo)前體細(xì)胞向骨骼遷移，而LMHFV可減少破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)中肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成[30]。Sakamoto等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞培養(yǎng)板底部行機(jī)械性振動(dòng)刺激后，破骨細(xì)胞的分化明顯增加，其原因可能為振動(dòng)刺激導(dǎo)致骨細(xì)胞上清液中RANKL/OPG比值升高。由此可見(jiàn)，LMHFV可影響破骨細(xì)胞功能、抑制破骨細(xì)胞增殖，但其對(duì)骨骼重構(gòu)過(guò)程中破骨細(xì)胞的潛在機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

1.4LMHFV與骨細(xì)胞 骨細(xì)胞源自成骨細(xì)胞，可嵌入礦化的骨基質(zhì)中，并通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性來(lái)調(diào)節(jié)骨骼重構(gòu)。此外，骨細(xì)胞可分泌促進(jìn)或抑制骨形成或吸收的細(xì)胞因子，通過(guò)樹(shù)突突觸與周?chē)?xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳遞。骨細(xì)胞被認(rèn)為是骨組織中的主要生理機(jī)械傳感器，可受LMHFV的影響。Thompson等[32]將LMHFV應(yīng)用于源自BMSC衍生的骨細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞標(biāo)記基因牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23的變化，表明LMHFV對(duì)骨細(xì)胞的分化或礦化沒(méi)有影響。然而，LMHFV可明顯降低SOST mRNA的表達(dá)，但RANKL和OPG不受影響。SOST是成骨細(xì)胞骨形成的抑制劑，可增加成骨細(xì)胞的骨形成。Sakamoto等[31]發(fā)現(xiàn)，在振動(dòng)刺激下，MLO-Y4細(xì)胞的RANKL mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而OPG水平不受影響，表明LMHFV對(duì)破骨細(xì)胞分化具有間接的積極作用。在分子水平上，間隙連接細(xì)胞間通訊可能通過(guò)連接蛋白43參與振動(dòng)誘導(dǎo)的細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[33]。綜上，LMHFV可激活RANKL表達(dá)并減少骨細(xì)胞中SOST，但不直接影響骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因。

2 LMHFV對(duì)骨再生的作用

骨折發(fā)生后的骨再生需要多種不同細(xì)胞類(lèi)型和生物介質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用。適當(dāng)機(jī)械性振動(dòng)刺激對(duì)于骨折愈合十分重要，通過(guò)LMHFV引入外部機(jī)械刺激可對(duì)骨形成產(chǎn)生積極影響。骨折發(fā)生時(shí)，局部炎癥反應(yīng)受到促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6以及抗炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-10的調(diào)節(jié)[34]。在去勢(shì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中，LMHFV影響大鼠骨折愈合過(guò)程中的早期炎癥反應(yīng)，骨質(zhì)疏松大鼠先天免疫的相對(duì)穩(wěn)定性有所變化[35]，但關(guān)于振動(dòng)刺激作用下炎癥反應(yīng)程度變化的認(rèn)識(shí)尚未達(dá)成共識(shí)[36]，仍需進(jìn)一步探究。同時(shí)，LMHFV被認(rèn)為可能是影響骨折愈合效果的重要機(jī)制。既往研究證實(shí)，M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)祖細(xì)胞的成骨分化[37]。骨折早期M1型巨噬細(xì)胞較多，而M2型巨噬細(xì)胞較少。Chow等[35]發(fā)現(xiàn)，LMHFV可促進(jìn)骨折早期再生性M2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，表明振動(dòng)刺激與巨噬細(xì)胞極化表型的改變有關(guān)。

骨折愈傷組織中，新血管的形成對(duì)骨再生十分重要。骨折部位的血液供應(yīng)減少導(dǎo)致動(dòng)物模型和患者的骨愈合效果不佳[38]。由于骨折后纖維愈傷組織的正常形成與骨折愈合結(jié)局高度相關(guān)，且在很大程度上受到骨折部位生物力學(xué)環(huán)境的影響，因此LMHFV施加機(jī)械刺激可能促進(jìn)骨折愈合。有研究表明，LMHFV可加速生理性骨折愈合，并能夠進(jìn)一步挽救去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松性骨折受損愈合[39]。機(jī)械性振動(dòng)刺激在骨折后1～3周通過(guò)增加愈傷組織的寬度和面積來(lái)促進(jìn)愈傷組織的形成[40]。但LMHFV僅可改善去卵巢動(dòng)物的骨折愈合，而其作用于雌激素正常分泌小鼠則表現(xiàn)為骨折愈合延遲[41]。在雌激素缺乏小鼠中，LMHFV(45 Hz、0.3 g)可顯著增加骨折部位礦化骨痂的體積，促進(jìn)骨形成[42]，可見(jiàn)雌激素在介導(dǎo)LMHFV骨吸收的作用中起著至關(guān)重要的作用。在分子水平上，ER的表達(dá)可能在振動(dòng)生物力學(xué)誘導(dǎo)的骨折加速愈合中起重要作用。在去卵巢大鼠的骨折中，LMHFV可增強(qiáng)mRNA水平以及蛋白水平上ERα的表達(dá)[40]，故推測(cè)ERα具有機(jī)械刺激感覺(jué)功能。

在振動(dòng)頻率方面，比較間歇性和連續(xù)性振動(dòng)的療效顯示，LMHFV作用于7 d間隔組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨折部位的愈傷組織形成面積最大，骨折愈合效果最佳[43-44]。由此可見(jiàn)，LMHFV可能通過(guò)影響骨折部位的局部炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞極化表型促進(jìn)纖維愈傷組織形成，進(jìn)而促進(jìn)骨再生，加速骨折愈合。

3 LMHFV對(duì)骨植入物的整合作用

復(fù)雜多樣的骨創(chuàng)傷類(lèi)型推動(dòng)了骨修復(fù)材料及相關(guān)材料的飛速發(fā)展。隨著材料學(xué)的發(fā)展，合金被制成有微孔隙植入物，其可與周?chē)趋栏玫亟Y(jié)合，并促進(jìn)合金之間的骨骼生長(zhǎng)，且不易發(fā)生松動(dòng)。使用3D打印的鈦合金骨小梁杯治療骨質(zhì)疏松且初次全髖關(guān)節(jié)置換的患者，結(jié)果顯示，與鉭杯組相比，鈦杯組的初始穩(wěn)定性及骨長(zhǎng)入效果更佳[45]。另有研究顯示，結(jié)合3D打印技術(shù)個(gè)性化定制鈦合金假體能夠成功為患者重建長(zhǎng)達(dá)11.7 cm的股骨骨缺損[46]。在椎體壓縮性骨折方面，與單純經(jīng)皮椎體成形術(shù)治療組相比，3D打印輔助經(jīng)皮椎體成形術(shù)治療組的椎體高度恢復(fù)率和骨水泥單側(cè)分布率均較高，且骨水泥滲漏發(fā)生率較低[47]。骨植入物骨整合是防止骨再生過(guò)程中植入物失敗的關(guān)鍵，植入物材料及其表面特性可能影響成骨細(xì)胞向植入物表面募集和分化，是避免植入物松動(dòng)的主要因素。

外部生物力學(xué)刺激可能是優(yōu)化骨整合的一種良好選擇，其骨合成代謝潛力已充分得到證明，骨-植入物界面的機(jī)械條件對(duì)骨再生和骨整合至關(guān)重要[48]。研究顯示，經(jīng)LMHFV干預(yù)的植入物周?chē)墓切纬擅黠@增加[49]。此外，LMHFV的應(yīng)用使骨-植入物界面的骨礦物質(zhì)密度明顯升高，且其作用可通過(guò)生物力學(xué)測(cè)試進(jìn)一步加強(qiáng)[50]。LMHFV不僅可直接促進(jìn)植入物與周?chē)墙M織的緊密接觸，還可在骨折愈合過(guò)程中，協(xié)同植入物與骨組織剪切力和骨折部位已形成的新骨共同促進(jìn)植入物骨整合[51]。LMHFV或阿侖膦酸鹽均可明顯提高去卵巢大鼠的骨整合，與阿侖膦酸鹽相比，LMHFV的作用較小，故認(rèn)為L(zhǎng)MHFV和抗骨質(zhì)疏松藥物可能對(duì)植入物的骨整合有附加作用[52]。

在接受LMHFV治療的動(dòng)物模型中，成骨相關(guān)基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和OPG均上調(diào)，表明LMHFV可促進(jìn)成骨細(xì)胞和礦化[53]。在LMHFV作用下，骨合成代謝的經(jīng)典Wnt/β聯(lián)蛋白通路中的β聯(lián)蛋白、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2表達(dá)明顯升高，而SOST蛋白表達(dá)明顯降低[54]。此外，RANKL mRNA水平顯著降低，其與破骨細(xì)胞的活性和分化與RANKL誘導(dǎo)結(jié)合有關(guān)[55]，故認(rèn)為L(zhǎng)MHFV可激活成骨細(xì)胞并抑制破骨細(xì)胞途徑，而骨植入物周?chē)蓹C(jī)械性振動(dòng)刺激引起的骨形成機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。綜上所述，LMHFV通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞生成和抗骨吸收作用改善雌激素和缺乏動(dòng)物模型中鈦植入物的骨整合。

4 小 結(jié)

機(jī)械刺激被認(rèn)為是骨骼重構(gòu)和再生中必不可少的調(diào)節(jié)器。在細(xì)胞分子學(xué)方面，機(jī)械刺激能夠增強(qiáng)MSC和成骨細(xì)胞的增殖和成骨分化，ER信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)尤其在成骨細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是介導(dǎo)LMHFV影響的重要機(jī)械敏感途徑。LMHFV還可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)，這可能影響MSC的增殖和分化。LMHFV可能是改善骨愈合和植入物整合過(guò)程的一種有前景的治療策略。LMHFV的臨床應(yīng)用需要充分認(rèn)識(shí)其分子機(jī)制、不良反應(yīng)及對(duì)患者的潛在益處，且其促進(jìn)骨折愈合的作用、治療方案和安全性需要更多臨床研究的證實(shí)?？梢?jiàn)，未來(lái)仍需不斷探索不同生物力學(xué)刺激模式對(duì)不同隊(duì)列患者的精確和可控治療。