袁華，李寧，吳令英

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院婦瘤科，北京 100021

卵巢癌是最常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。2020 年全球估計新發(fā)卵巢癌31.4 萬例，病死20.8 萬例[1]。2015 年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國每年新發(fā)卵巢癌超5.2 萬例，病死超2.3 萬例，且呈明顯上升趨勢[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的發(fā)生與DNA 雙鏈損傷修復缺陷密切相關。

DNA 雙鏈損傷修復維持著基因組穩(wěn)定和細胞的生存。G1期細胞周期的經(jīng)典非同源末端連接修復（classical non-homologous end-joining，C-NHEJ）和S/G2期的同源重組修復是主要的DNA 損傷修復方式。同源重組修復是高保真的DNA 雙鏈損傷修復。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）1、BRCA2、RAD50、RAD51、RAD51C、PALB2、FANCA、ATM、ATR、細胞周期檢測點激酶（cell cycle checkpoint kinase，CHEK）1、CHEK2等均是同源重組修復的重要基因。同源重組修復基因若出現(xiàn)異常，會導致細胞同源重組修復缺陷（homologous recombination deficiency，HRD），細胞會采用其他易錯的修復方式進行DNA 損傷修復，進而導致基因組不穩(wěn)定，促進腫瘤的發(fā)生[3]。同源重組修復缺陷細胞對鉑類化療藥物及其他誘導DNA雙鏈損傷的藥物具有較高的敏感性[4]。15%～20%的上皮性卵巢癌患者攜帶BRCA1/2胚系突變（10%～15%）或體細胞突變（6%～7%），約10%的上皮性卵巢癌患者的BRCA1基因啟動子存在過甲基化[5]，而其他同源重組修復基因的突變頻率為4%～5%[3]。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑是主要針對BRCA1/2突變或HRD卵巢癌的靶向治療藥物，作用于BRCA1/2異常或HRD 卵巢癌細胞后，細胞DNA 單鏈損傷不能被修復，可促進DNA 雙鏈損傷、斷裂的發(fā)生，引起DNA 復制叉停止，導致合成致死，從而靶向殺滅腫瘤細胞[4]。多項臨床試驗證實，PARP 抑制劑對BRCA1/2突變或HRD 卵巢癌患者具有較好的療效，特別是用于鉑敏感復發(fā)卵巢癌患者的維持治療、BRCA1/2突變晚期卵巢癌的一線維持治療及后線治療等[6-14]。此外，PARP 抑制劑在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌的治療中也顯示出了令人滿意的療效。目前，已被美國食品藥品管理局（FDA）批準的PARP抑制劑包括4種，即奧拉帕利（Olaparib）、盧卡帕利（Rucaparib）、尼拉帕利（Niraparib）、他拉唑帕利（Talazoparib），其中奧拉帕利、尼拉帕利已經(jīng)在中國上市。國產(chǎn)PARP 抑制劑——氟唑帕利也已經(jīng)被批準用于伴有胚系BRCA1/2基因突變的鉑敏感復發(fā)卵巢癌的后線治療。因此，將會有更多的腫瘤患者從PARP 抑制劑的治療中獲益[15]。

但部分攜帶同源重組修復基因突變的上皮性卵巢癌或其他腫瘤患者對PARP 抑制劑原發(fā)或獲得性耐藥[16-17]。已有研究發(fā)現(xiàn)了PARP 抑制劑耐藥的機制，主要集中于細胞同源重組修復功能的恢復。同源重組修復通路上的重要基因（BRCA1/2、RAD51、PALB2等）通過繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變或基因內(nèi)缺失恢復相應蛋白的功能，可再次激活同源重組修復功能，進而導致PARP 抑制劑耐藥。本文將對卵巢癌同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變導致PARP 抑制劑耐藥的研究進展進行綜述。

1 同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變

2008 年，Edwards 等[18]利 用 攜 帶BRCA2c.6174delT 移碼突變的人胰腺癌細胞Capan-1，衍生出PARP 抑制劑耐藥克隆的細胞。該研究發(fā)現(xiàn)，耐藥克隆的細胞可以形成DNA 損傷誘導的RAD51核聚集灶，能夠抑制細胞毒性藥物誘導的基因組不穩(wěn)定。進一步研究提示，耐藥細胞系出現(xiàn)繼發(fā)性基因內(nèi)缺失，可形成逆轉(zhuǎn)突變，恢復BRCA2的開放閱讀框，進而恢復部分BRCA2的功能。隨后，多項研究在臨床接受化療或PARP 抑制劑治療的腫瘤患者中同樣發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中繼發(fā)性同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變是重要的耐藥機制。

Norquist 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變 與化療耐藥相關。該研究通過對攜帶BRCA1/2胚系突變的64 例初治卵巢癌和46 例復發(fā)卵巢癌患者的腫瘤組織進行BRCA1/2突變檢測，結果發(fā)現(xiàn)，46例復發(fā)卵巢癌中有13 例（28.3%）存在逆轉(zhuǎn)突變，而64 例初治卵巢癌僅2 例（3.1%）存在逆轉(zhuǎn)突變（P＜0.01）。該研究26 例鉑類耐藥的復發(fā)患者中有12例（46.2%）存在繼發(fā)性BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，而19 例鉑類敏感復發(fā)患者中僅有1 例（5.3%）存在繼發(fā)性BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變（P=0.003）；結合功能試驗提示，攜帶BRCA1/2胚系突變患者的卵巢癌組織繼發(fā)性體細胞逆轉(zhuǎn)突變可恢復BRCA1/2的功能，逆轉(zhuǎn)突變的存在可預測機體對鉑類藥物及對PARP 抑制劑的耐藥性。

Lheureux 等[20]在1 例長期（＞7 年）接受奧拉帕利治療獲益的BRCA1基因胚系野生型的鉑敏感復發(fā)性卵巢高級別漿液性腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，該患者在最初診斷時腫瘤組織中野生型BRCA1基因等位基因缺失、另一等位基因攜帶W353*無義突變，且腫瘤組織中缺乏能夠恢復BRCA1 蛋白活性的等位基因，提示該患者可能會被治愈。因此，研究者認為腫瘤組織中BRCA1/2雙等位基因缺失/異常可能是對PARP 抑制劑長期敏感的潛在標志。Barber 等[21]通過對奧拉帕利耐藥的乳腺癌、卵巢癌患者治療前后穿刺腫瘤組織標本進行大規(guī)模平行測序發(fā)現(xiàn)，患者均存在BRCA2逆轉(zhuǎn)突變，這些突變能夠恢復BRCA2 蛋白的功能。Waks 等[22]納入8 例接受PARP 抑制劑和化療耐藥的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，患者均攜帶BRCA1/2突變，收集患者治療前后腫瘤組織或細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）標本，通過測序發(fā)現(xiàn)，8 例患者中4 例存在BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，提示逆轉(zhuǎn)突變可能是乳腺癌對PARP 抑制劑、化療耐藥的重要機制。

除BRCA1/2基因外，同源重組修復的其他基因的逆轉(zhuǎn)突變也與PARP 抑制劑耐藥相關。Kondrashova 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，盧卡帕利耐藥的復發(fā)卵巢癌患者腫瘤組織中存在RAD51C和RAD51D基因逆轉(zhuǎn)突變，這些逆轉(zhuǎn)突變能夠恢復開放閱讀框；進一步的功能研究證實，盧卡帕利耐藥與這些逆轉(zhuǎn)突變相關。

除卵巢癌、乳腺癌外，胰腺癌患者中繼發(fā)性同源重組修復基因體細胞逆轉(zhuǎn)突變也與PARP 抑制劑耐藥相關。研究顯示，1 例63 歲胰腺導管腺癌患者攜帶BRCA26714 位堿基缺失突變，在接受PARP抑制劑治療后逐漸出現(xiàn)耐藥，研究者在耐藥腫瘤細胞中檢測到了BRCA2繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變，該逆轉(zhuǎn)突變能夠恢復BRCA2 蛋白的功能[24]。

2 cfDNA 檢測逆轉(zhuǎn)突變

檢測cfDNA中突變是近年來逐漸興起的重要的療效監(jiān)測手段。多項研究對患者外周血cfDNA 的檢測發(fā)現(xiàn)，同源重組修復基因繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變與PARP 抑制劑耐藥相關，這為動態(tài)監(jiān)測PARP 抑制劑的療效提供了可能。Christie 等[25]的研究共納入30 例攜帶BRCA1/2胚系突變的卵巢高級別漿液性腺癌患者，包括14 例初治患者和16 例復發(fā)患者，其中24 例患者采集到配對的腫瘤組織和血漿標本。該研究結果顯示，5 例患者出現(xiàn)基因內(nèi)逆轉(zhuǎn)突變，恢復BRCA1/2開放閱讀框，且這5 例患者均為復發(fā)患者；5 例患者中3 例患者同時在配對的血漿cfDNA 中檢測出基因內(nèi)逆轉(zhuǎn)突變，這些患者對PARP 抑制劑耐藥。Weigelt 等[26]前瞻性納入24 例BRCA1/2胚系突變的卵巢癌、乳腺癌患者，包括19例鉑耐藥/難治性卵巢癌患者和5 例擬接受鉑類化療和（或）PARP 抑制劑治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，該研究對患者血漿cfDNA 進行大規(guī)模平行測序結果顯示，在4 例卵巢癌患者（21%）和2 例乳腺癌患者（40%）血漿cfDNA 中檢測出了多樣化、多克隆的BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，其中1 例乳腺癌患者在PARP 抑制劑治療前cfDNA 中就檢測出了逆轉(zhuǎn)突變，該患者對PARP 抑制劑原發(fā)耐藥，PARP 抑制劑治療后cfDNA 中逆轉(zhuǎn)突變進一步富集；功能研究表明，部分逆轉(zhuǎn)突變可恢復BRCA1/2 蛋白的功能。Lin 等[27]對攜帶BRCA1/2胚系或體系突變的卵巢高級別漿液性腺癌患者治療前和進展后血漿cfDNA 進行測序分析，結果發(fā)現(xiàn)，鉑難治、鉑耐藥復發(fā)、鉑敏感復發(fā)卵巢癌患者cfDNA 中逆轉(zhuǎn)突變率分別為18%（2/11）、13%（5/38）、2%（1/48），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049）；在盧卡帕利治療患者中，治療前cfDNA 中無BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變患者的中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）明顯長于有逆轉(zhuǎn)突變患者（9.0 個月vs1.8 個月，HR=0.12，P＜0.01）；對78 例疾病進展患者的cfDNA 進行測序發(fā)現(xiàn)，8 例患者具有BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變。

ARIEL2 研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性卵巢癌患者盧卡帕利治療前cfDNA、腫瘤組織中共檢測出10 例（8.9%，10/112）患者存在BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，這10例患者對盧卡帕利均不敏感，包括6 例疾病進展、4例疾病穩(wěn)定，中位PFS 為1.8 個月（95%CI：1.7～5.4個月）[28]。ARIEL4 研究中共有23 例（6.6%）患者攜帶BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變，進一步分析發(fā)現(xiàn)，與化療患者（n=10）相比，盧卡帕利治療患者（n=13）的中位PFS 更短（2.9 個月vs5.5 個月，HR=2.769，95%CI：0.989～7.755），該 研 究 也 是 第 一 項 證 實BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變可預測PARP 抑制劑耐藥的前瞻性隨機研究[29]。

此外，在前列腺癌患者血漿cfDNA 中也發(fā)現(xiàn)了BRCA2、PALB2基因逆轉(zhuǎn)突變與奧拉帕利耐藥相關[30-31]。

3 逆轉(zhuǎn)突變的形成機制

Tobalina 等[32]對近年來發(fā)表的BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變相關文獻進行總結，共納入327 例患者，其中卵巢癌234 例、乳腺癌27 例、胰腺癌13 例、前列腺癌11 例、原發(fā)灶不明腫瘤42 例，結果顯示，327 例患者在接受鉑類藥物或PARP 抑制劑治療后均出現(xiàn)耐藥，其中26%（86/327）患者攜帶BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，對這些存在逆轉(zhuǎn)突變的患者進一步分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2基因11 號外顯子編碼的大多數(shù)氨基酸序列對產(chǎn)生鉑類化療或PARP 抑制劑耐藥不是必要的；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2基因內(nèi)缺失導致逆轉(zhuǎn)突變形成位點的周圍具有DNA 微同源序列的顯著累積，尤其是BRCA2，這種微同源序列的形成與選擇性非同源末端連接（alternative non-homologous end-joining，Alt-NHEJ）修復有關。表明抑制Alt-NHEJ 修復可減少逆轉(zhuǎn)突變的形成，延長PARP抑制劑的持續(xù)時間。Alt-NHEJ 是一種獨特的DNA損傷修復方式，其與同源重組修復機制具有相同的底物，但Alt-NHEJ 是一種易錯的修復機制，具有高度的誘變性，會引起染色體重排[33-35]。研究認為，Alt-NHEJ 是一種補充修復機制，在正常細胞中，同源重組修復抑制Alt-NHEJ 修復機制，而當腫瘤細胞同源重組修復和C-NHEJ 修復異常時，細胞的DNA 雙鏈破壞主要通過Alt-NHEJ 機制修復，進而得以存活[33-34]。微同源末端連接（microhomology-mediated end-joining，MMEJ）是Alt-NHEJ 最重要的修復方式。BRCA1/2等同源重組修復基因缺陷卵巢癌細胞的存活依賴MMEJ 修復，這種易錯的修復方式會導致同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變，進而對PARP 抑制劑耐藥。因此，抑制MMEJ 修復是克服PARP 抑制劑耐藥的重要方式。

4 逆轉(zhuǎn)PARP 抑制劑耐藥

POLQ基因編碼的Polθ蛋白（polymerase θ）是一種多功能酶。Polθ同時具有DNA 聚合酶和解旋酶的功能，是Alt-NHEJ 修復機制中重要的蛋白[36]。POLQ基因在細胞中重要的功能是參與MMEJ 修復。抑制腫瘤細胞Polθ的功能可減少MMEJ 修復，進而有效抑制因同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變而導致對PARP 抑制劑耐藥。

Zatreanu 等[37]通過細胞和動物實驗發(fā)現(xiàn)，Polθ聚合酶變構抑制劑——ART558，能夠抑制Polθ介導的DNA 損傷修復，ART558 能夠在BRCA1/2突變腫瘤細胞中誘導DNA 損傷和合成致死效應，并增強PARP 抑制劑的作用。Zhou 等[38]通過高通量小分子篩選發(fā)現(xiàn)，抗生素新生霉素（novobiocin，NVB）是Polθ的一種特異性抑制劑，可在體外和體內(nèi)選擇性地殺死HRD 腫瘤細胞；NVB 可直接與Polθ蛋白的ATPase 結構域結合，抑制其ATPase 活性，并消耗Polθ；NVB 在轉(zhuǎn)移瘤模型中可殺死HRD的乳腺癌和卵巢癌細胞，PARP 抑制劑獲得性耐藥的BRCA缺陷腫瘤細胞對NVB 治療敏感。表明NVB 單獨或與PARP 抑制劑聯(lián)合均可用于HRD 腫瘤的治療，包括PARP 抑制劑獲得性耐藥的腫瘤患者。Pettitt 等[39]通過生物信息學軟件NetMHCpan 4.0 對BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變序列進行分析發(fā)現(xiàn)，這些逆轉(zhuǎn)突變可編碼新的抗原，因此，這些逆轉(zhuǎn)突變患者可能會從嵌合抗原受體T 細胞療法（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、免疫檢查點抑制劑或抗腫瘤疫苗的治療中獲益。期待未來Polθ抑制劑或BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變的新抗原能夠有效改善PARP抑制劑耐藥患者的預后。

Kim 等[40]在鉑耐藥和繼發(fā)性PARP 抑制劑耐藥患者的移植瘤模型中都觀察到了PARP 抑制劑聯(lián)合共濟失調(diào)毛細血管擴張和Rad3 相關激酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase，ATR）抑制劑的持久療效；且PARP-ATR 抑制劑對BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變引起的PARP 抑制劑耐藥模型同樣具有良好的療效。因此，PARP-ATR 抑制劑是一種非常有前景的治療策略。由于PARP-ATR 抑制劑在基礎研究中的良好療效，Shah 等[41]和Wethington 等[42]開展了PARP-ATR 抑制劑相關的CAPRI 研究，該研究旨在評價ATR 抑制劑（AZD6738）聯(lián)合PARP 抑制劑（奧拉帕利）治療復發(fā)性卵巢癌的療效，其中隊列C 是探討奧拉帕利聯(lián)合AZD6738 在PARP 抑制劑獲得性耐藥的復發(fā)性卵巢癌中的療效，共納入13 例既往接受PARP 抑制劑治療進展的鉑敏感復發(fā)性卵巢高級別漿液性癌患者，其中9 例為BRCA1/2胚系突變，3 例為BRCA1/2體系突變，1 例為HRD 陽性，既往PARP 抑制劑治療的中位時間為13 個月（4～60 個月）。上述CAPRI 研究結果顯示：患者的客觀緩解率為46.2%（6/13），6 例患者均為部分緩解，PFS 為7.5 個月（95%CI：4.7～NR），沒有患者因不良反應退出研究。該研究表明奧拉帕利聯(lián)合AZD6738 具有良好的耐受性，首次提出了ATR 抑制劑在HRD 患者中逆轉(zhuǎn)PARP 抑制劑耐藥性的潛力。

此外，其他針對PARP 抑制劑耐藥性的研究也在進行中，包括WEE1 抑制劑、DNA 依賴性蛋白激酶抑制劑等[43-44]。但因同源重組修復基因逆轉(zhuǎn)突變導致對PARP 抑制劑耐藥的患者能否從這些藥物中獲益尚不清楚。

5 小結與展望

綜上所述，BRCA1/2、RAD51、PALB2基因通過繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變恢復同源重組修復功能是PARP抑制劑耐藥的重要機制。Polθ、ATR 抑制劑等對這些PARP抑制劑耐藥腫瘤患者具有良好的療效。隨著越來越多的患者接受PARP 抑制劑治療，動態(tài)監(jiān)測PARP抑制劑治療患者血漿cfDNA中基因突變情況，有助于指導臨床對腫瘤患者進行精準治療，評估臨床療效及患者的預后。