孟菲菲 楊長偉 高志禮 王花欣*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355 3.華東交通大學(xué)，江西 南昌 330013

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身代謝性骨病，其特征為骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞。近年來，中醫(yī)藥療法被廣泛應(yīng)用于OP的防治，大量研究開始從不同角度探究其分子機(jī)制。外泌體作為新近研究熱點(diǎn)，在細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞中發(fā)揮著不可取代的作用。miRNA作為外泌體的重要活性成分，可經(jīng)由外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，調(diào)控靶基因表達(dá)，參與骨重建過程。

1 外泌體miRNA與骨質(zhì)疏松

外泌體是具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的一種囊泡小體，其直徑為40～160 nm，主要由蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)等生物大分子組成，在細(xì)胞間的信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[1]。外泌體最初是由內(nèi)吞作用形成，是從多種類型的細(xì)胞中，通過旁分泌釋放到細(xì)胞外的囊泡。人體各種具有活性的細(xì)胞在生理或者病理的條件下幾乎都可以產(chǎn)生外泌體，廣泛分布在各種體液，如血液、唾液、尿液和母乳中。miRNA是一類微小的內(nèi)源性非編碼RNA，由19～25個(gè)核苷酸組成，作為外泌體的一種功能性成分，可通過結(jié)合靶基因mRNA的 3’ UTR區(qū)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，調(diào)控受體細(xì)胞的生命活動(dòng)。

OP是一類以骨量減少，骨骼結(jié)構(gòu)塌陷及易骨折為主要特征的代謝性疾病，在50歲以上人群中發(fā)病率約為30 %。臨床上制定了以DXA測(cè)量BMD的診斷方法，即T值低于同種族、同性別正常青年人的2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[2]。OP的發(fā)病機(jī)制在于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡即骨重建平衡被打破。外泌體miRNA可通過多種途徑直接或間接作用于骨重建過程，影響著OP的發(fā)生發(fā)展。見圖1。

2 外泌體miRNA參與骨形成過程

骨形成是骨重建的重要環(huán)節(jié)，涵蓋了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌膠原纖維及骨基質(zhì)礦化的過程[3]。外泌體miRNA可通過調(diào)控骨形成相關(guān)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化及功能，干預(yù)骨重建進(jìn)程[4]。

骨形態(tài)蛋白2(BMP-2)是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為成骨主要因素，通過與靶細(xì)胞上的酶受體結(jié)合，調(diào)節(jié)下游Smad信號(hào)通路，最終激活成骨基因，從而促進(jìn)新骨形成[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，BMSCs來源的外泌體(BMSCs-EXOs)miR-153與miR-214可以通過直接靶向BMP-2抑制成骨細(xì)胞增殖分化，參與調(diào)控骨形成。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)作為骨骼發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過激活多個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成過程[8]。研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs miR-150-3p、miR-1275及miR-21可通過上調(diào)Runx2的表達(dá)來提高成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨形成。而miR-30a、miR-23a、miR-189和miR-106則通過抑制Runx2的表達(dá)來降低成骨細(xì)胞分化，抑制骨形成[12-14]。此外，BMSCs-EXOs miR-122-5p和miR-182-5p分別通過下調(diào)靶基因SPRY2和腺苷酸環(huán)化酶6(ADCY6)的表達(dá)，激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)MSCs的增殖，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[15-16]。而miR-144通過下調(diào)分泌型卷曲相關(guān)蛋白 1(Sfrp1)，激活Wnt信號(hào)通路，減少細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)新骨生成[17]。

MSCs成骨和脂肪分化之間的平衡對(duì)于維持骨穩(wěn)態(tài)非常重要，在減少骨量丟失方面，可以通過抑制成脂分化來促進(jìn)骨形成及成骨分化，從而增加骨量來實(shí)現(xiàn)。研究[18]發(fā)現(xiàn),miR-424在脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hAD-MSCs)成脂誘導(dǎo)過程中的表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)一步的研究表明其可通過調(diào)節(jié)蛋白EID-1和轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)量，有效抑制hAD-MSCs的脂肪分化，促進(jìn)骨形成。

3 外泌體miRNA參與骨吸收過程

骨吸收主要由巨噬細(xì)胞衍生的破骨細(xì)胞介導(dǎo)，通過分泌多種酶，使周圍骨組織溶解。隨后，成骨細(xì)胞遷移到這個(gè)部位進(jìn)一步骨形成，維持骨穩(wěn)態(tài)。核因子-κB配體受體激活劑(RANKL)是破骨細(xì)胞分化的重要啟動(dòng)因子，通過刺激活化T細(xì)胞胞核因子(NFATc1)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[19]。

研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，miR-124與miR-506-3p可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的表達(dá)來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成，但作用相反。miR-124可通過抑制NFATc1的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞分化，減少骨吸收；而miR-506-3P則通過促進(jìn)NFATc1的表達(dá)，導(dǎo)致各種骨吸收酶的下游分泌，正向調(diào)控破骨細(xì)胞分化，加速骨吸收，進(jìn)而致使骨量丟失。

證據(jù)表明，miR-31是骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMMs)向破骨誘導(dǎo)分化的過程中表達(dá)最為上調(diào)的miRNA之一[21-22]；而在此過程中miR-503-3p和miR-218的表達(dá)水平降低[23-24]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，miR-503-3p通過下調(diào)靶基因肝素酶基因(Hpse)的表達(dá)來達(dá)到抑制破骨細(xì)胞分化的目的，而miR-218通過抑制TNFR1的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞生成，從而抑制骨吸收。此外，miR-21既可通過增加骨保護(hù)素(OPG)水平來促進(jìn)新骨形成，也可以通過靶向PTEN激活PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和骨吸收[21-22]。

圖1 外泌體的形成及其在骨重建中的作用Fig.1 Formation of exosomes and their role in bone reconstruction

4 外泌體miRNA與血管生成

血管的生成對(duì)促進(jìn)骨形成，維持骨穩(wěn)態(tài)具有重大意義。在骨骼發(fā)育以及骨折愈合這一過程，血管的生成和骨的形成是耦合的，由骨細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是骨生成和血管生成耦合的重要調(diào)節(jié)因子[25]。

研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs miR-214-3p和miR-195都能夠參與調(diào)控VEGF的表達(dá)，從而影響血管的生成。不同的是，miR-214-3p通過降低VEGF的表達(dá)，釋放負(fù)調(diào)節(jié)血管生成信號(hào)，抑制血管生成；miR-195的高表達(dá)能夠降低MSCs對(duì)血管生成的旁分泌效應(yīng)以及VEGF的表達(dá)水平，對(duì)血管生成具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

此外，有證據(jù)證明，miR-29a、miR-672、miR-126及miR-136-3p對(duì)血管生成具有積極作用[28-31]。miR-29a能夠有效的促進(jìn)小鼠血管的生成和成骨，miR-672在BMP-2誘導(dǎo)的血管生成過程中顯著上調(diào)，而miR-126和miR-136-3p則能夠通過觸發(fā)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)產(chǎn)生信號(hào)應(yīng)答，從而促進(jìn)血管生成加速骨形成過程，為OP提供新的治療靶點(diǎn)。

5 外泌體miRNA與骨免疫學(xué)

骨免疫學(xué)是研究骨骼與免疫系統(tǒng)之間相互調(diào)控的交叉學(xué)科，其研究內(nèi)容包含了骨骼與免疫兩系統(tǒng)之間密切且復(fù)雜的相互作用機(jī)制。越來越多的研究[32]證明，外泌體miRNA可通過調(diào)控骨免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，維持骨平衡穩(wěn)態(tài)，控制骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的通訊。

IL-6促進(jìn)破骨細(xì)胞生成以及提高其活性，是通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)的[33]。研究[34-37]發(fā)現(xiàn)miR-495、miR-200c、miR-146a、miR-27a等可通過抑制IL-6的表達(dá)，促進(jìn)新骨形成。

TNF-α作為抑制成骨細(xì)胞增殖分化的促炎癥因子，可降低其活性，并且能夠加速成骨細(xì)胞的凋亡[38]。研究[39-45]表明，miR-21、miR-183、miR-181、miR-335-3p、miR-203、miR-145、miR-107等通過調(diào)控TNF-α表達(dá)，抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨生成，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨形成。

M-CSF作為破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑，能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。而miR-146a、miR-21、miR-143-3p等通過減少骨微環(huán)境中M-CSF的水平，抑制破骨細(xì)胞分化，從而減少骨量丟失[46-48]。

6 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)外泌體miRNA作用于骨質(zhì)疏松

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將OP歸屬于“骨痿”“骨枯”和“骨極”等范疇?！夺t(yī)經(jīng)精義》曰：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也。髓者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強(qiáng)?！睍姓J(rèn)為骨髓的充盈可以決定骨骼的生長與發(fā)育，腎精充足，則骨髓化生泉源不竭。若腎精虧損，骨髓不能正?；?，逐漸枯竭，就會(huì)出現(xiàn)腰膝酸軟、步履不穩(wěn)等骨痿病的癥狀。因此，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎精虧損為該病的主要致病因素，腎虛為該病的主要發(fā)病機(jī)制?！秲?nèi)經(jīng)》提出了其治療原則：“骨痿者補(bǔ)腎以治之”。而多種補(bǔ)腎壯骨的中藥單體、復(fù)方制劑及針灸已用于OP的防治，外泌體作為一種新型的生物標(biāo)志物，參與多種生物學(xué)及病理過程，且在物質(zhì)交換以及信息傳遞等方面發(fā)揮重要作用，由于外泌體miRNA具有穩(wěn)定的細(xì)胞通訊功能，使其成為潛在的中醫(yī)藥物載體，大量的研究資料證實(shí)其藥效機(jī)制與外泌體miRNA密切相關(guān)。見圖2。

圖2 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)的外泌體miRNA作用于骨質(zhì)疏松癥Fig.2 The effect of medically regulated exosome miRNA on osteoporosis

6.1 單體

淫羊藿苷是淫羊藿主要的黃酮類活性物質(zhì)，具有促骨形成、抗炎及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。袁雯霞等[49]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷在缺氧環(huán)境下可進(jìn)一步促進(jìn)MSCs的增殖活性，抑制細(xì)胞的凋亡，并且顯著提高了miR-126、miR-210、miR-322和miR-378a-3p在MSCs當(dāng)中的表達(dá)。楊傲飛[50]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)淫羊藿苷處理BMSCs后，通過調(diào)控miR-122-5p/Runx2/CXCR4信號(hào)軸，促進(jìn)BMSCs的成骨分化。孫海濤[51]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠通過調(diào)控lncRNA TIM3/miR-214-5P/samd4軸促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而miR-664-3p通過下調(diào)靶基因Smad4和Osx的表達(dá)而抑制成骨細(xì)胞分化，闡釋了淫羊藿苷治療OP的分子機(jī)制[52]。異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要活性成分，具有較強(qiáng)的抗骨質(zhì)疏松活性。研究[53]發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素刺激BMSCs后分泌的外泌體能夠上調(diào)ALP、OPG、BMP2的表達(dá)，并可能通過調(diào)控circ8604/miR-26b-3p/ERα信號(hào)軸影響成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1)的成骨分化，進(jìn)而調(diào)控骨代謝。此外，葛根素是從葛根中提取的異黃酮類化合物，張瑩瑩[54]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-204可負(fù)調(diào)節(jié)Runx2抑制成骨分化，并進(jìn)一步驗(yàn)證了葛根素通過下調(diào)miR-204促進(jìn)Runx2的蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，金絲桃苷作為一種具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種作用的中藥單體，安宏強(qiáng)[55]推測(cè)金絲桃苷可能通過調(diào)控miRNA-19a-5p/IL-17A信號(hào)軸預(yù)防OP的發(fā)生。

6.2 復(fù)方

已有研究表明，中藥復(fù)方可通過影響外泌體miRNA分泌量或內(nèi)含成分延緩OP的發(fā)展，左歸丸、健骨顆粒、補(bǔ)腎強(qiáng)督方、補(bǔ)腎健脾活血方等均可通過調(diào)節(jié)外泌體miRNA防治骨質(zhì)疏松。

左歸丸可通過上調(diào)miR-34a，抑制其靶基因Tgif2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)成脂相關(guān)因子PPRAγ，上調(diào)成骨核轉(zhuǎn)錄因子Runx2，促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化[56]。張楚天等[57]在體外實(shí)驗(yàn)中觀察到健骨顆粒含藥血清組miR-141的表達(dá)量降低，證明了健骨顆?？梢种苖iR-141的表達(dá)，提高Runx2的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)成骨分化的作用。孫文婷[58]研究顯示補(bǔ)腎強(qiáng)督方可能部分通過下調(diào)IncRNA H19表達(dá)來上調(diào)miR-22表達(dá)，同時(shí)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，從而干預(yù)hBMSCs的成骨分化。汪悅東[59]研究表明補(bǔ)腎健脾活血方可以通過調(diào)控miR-210提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)Runx2、OPG、OPN的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨礦化。

6.3 針灸

有學(xué)者[60]發(fā)現(xiàn)，針灸療法能夠改善骨代謝過程，抑制骨吸收的同時(shí)促進(jìn)新骨形成，使機(jī)體處于平衡狀態(tài)，從而達(dá)到治療OP的效果。外泌體作為細(xì)胞間溝通傳輸?shù)谋匾攀?，可在不同?xì)胞和系統(tǒng)之間傳遞信息[61]。劉小亞[62]提出外泌體在針灸干預(yù)的過程中充當(dāng)信使，廣泛的接受針灸刺激信號(hào)并作出回應(yīng)，繼而激發(fā)針灸的雙向調(diào)節(jié)作用，維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

葉靜等[63]為進(jìn)一步探究針刺治療骨病中外泌體的作用，檢測(cè)了血清外泌體miRNA的釋放趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)針刺可以降低血清外泌體miR-1228-5p、miR-1296-5p和miR-3168的表達(dá)，并通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路，影響細(xì)胞凋亡及自噬，從而發(fā)揮治療作用。

7 展望

OP作為骨科常見的疾病之一，目前其發(fā)病機(jī)制已經(jīng)有較為成熟的研究。但從微觀角度上來說，其發(fā)病機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。外泌體miRNA作為近年來的研究熱點(diǎn)，可通過調(diào)控成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖分化，影響血管生成及參與骨免疫學(xué)等途徑參與OP的發(fā)生發(fā)展，但作為OP的特異性生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)仍有相對(duì)局限性。此外，中醫(yī)藥作為我國獨(dú)特的治療方式，已有一些學(xué)者從微觀角度上研究中醫(yī)藥可能通過影響外泌體miRNA的表達(dá)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展及防治，但相關(guān)研究較少，且存在一些局限性，如體外實(shí)驗(yàn)用含藥血清進(jìn)行干預(yù)時(shí)，血清本身對(duì)外泌體的分泌會(huì)產(chǎn)生影響，增加了研究藥物機(jī)制的不確定性。而外泌體作為藥物載體，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而外泌體是否可用于中藥的靶向研究將會(huì)成為將來的研究方向。