李志超 薛海鵬 蘇輝 徐展望 譚國(guó)慶*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨密度降低，骨結(jié)構(gòu)惡化以及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的慢性骨骼疾病[1]。在我國(guó)，50歲以上人群中約有19.2%患有骨質(zhì)疏松，65歲以上人群患病率更是高達(dá)32.0%[2]。骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)決定著OP發(fā)生發(fā)展，而機(jī)械刺激、表觀遺傳調(diào)節(jié)和激素等因素造成的骨代謝紊亂導(dǎo)致骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生異常變化，常表現(xiàn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化失衡，成骨細(xì)胞功能衰減、骨形成不足與破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、骨吸收加快，最終導(dǎo)致凈骨量丟失[3]。來源于成骨細(xì)胞的骨細(xì)胞也在骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，通過嵌入基質(zhì)中充當(dāng)能夠?qū)C(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為生物化學(xué)信號(hào)的傳感器，其功能的紊亂將導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成失衡[4]。非編碼RNAs(non-coding RNAs, ncRNAs)作為重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自噬等細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。其中，自噬作為細(xì)胞成分循環(huán)的關(guān)鍵，在維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色。最近，許多研究闡明了ncRNAs和自噬之間的聯(lián)系在各種疾病中全新和關(guān)鍵的作用。防治OP是骨骼疾病研究中的重要領(lǐng)域，為了充分發(fā)揮ncRNAs與自噬相互作用在OP中的治療效果，需要分析ncRNAs與自噬之間的串?dāng)_對(duì)骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響。因此，筆者總結(jié)了自噬相關(guān)ncRNAs，主要是微小RNAs(microRNAs, miRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)和環(huán)狀RNAs(circular RNAs, circRNAs)在OP中作用的最新研究進(jìn)展，并就它們對(duì)調(diào)節(jié)BMSCs、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生理功能的作用機(jī)制展開討論。

1 自噬相關(guān)ncRNAs與OP的關(guān)系

ncRNAs，主要包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs等，miRNAs是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的ncRNAs，可以通過互補(bǔ)堿基配對(duì)識(shí)別靶mRNAs的3’UTR區(qū)域，進(jìn)而降解或抑制靶mRNAs表達(dá)[5]。lncRNAs是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的ncRNAs，可以通過自身核苷酸序列或折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)與底物結(jié)合，并通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的多種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。circRNAs主要由反向剪接形成，是內(nèi)源性共價(jià)閉合環(huán)狀RNA分子，可作為miRNAs海綿調(diào)節(jié)miRNAs相關(guān)細(xì)胞過程[6]。隨著深度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多影響骨代謝的具有生物學(xué)意義的ncRNAs被挖掘。例如，Jin等[7]使用基于Illumina測(cè)序確定了260個(gè)circRNAs、70個(gè)lncRNAs和13個(gè)miRNAs在絕經(jīng)后OP患者與健康人群中存在差異表達(dá)。

自噬作為主要分解代謝途徑之一，可以去除和回收受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，是細(xì)胞必要的動(dòng)態(tài)平衡過程。在基礎(chǔ)水平上，該過程在質(zhì)量控制中發(fā)揮作用，從而參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；在各種壓力下，例如營(yíng)養(yǎng)剝奪或缺氧，自噬作為應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，有助于細(xì)胞存活直到條件改善[8]。骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡亦是協(xié)調(diào)持續(xù)的，在BMSCs、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能協(xié)同作用下，骨骼系統(tǒng)被不斷重塑以保持強(qiáng)度發(fā)揮正常功能[9]。由于自噬的循環(huán)特性和持續(xù)的骨重塑，自噬被認(rèn)為在骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。最近，自噬相關(guān)ncRNAs被證明參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、椎間盤退變和內(nèi)分泌疾病等[10]。因此，可以認(rèn)為ncRNAs與自噬的相互作用也可能是OP的潛在分子機(jī)制，并可能為OP藥理學(xué)控制提供新的治療靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 自噬相關(guān)miRNAs、lncRNAs、circRNAs在OP中作用機(jī)制圖Fig.1 Mechanism diagram of autophagy-related miRNAs, lncRNAs and circRNAs in OP

2 自噬相關(guān)ncRNAs調(diào)控BMSCs和成骨細(xì)胞作用機(jī)制

BMSCs分化去向在骨形成和吸收之間的平衡方面發(fā)揮著重要作用，其通常分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，但衰老過程中其成骨分化逐漸減弱，這種分化失衡造成骨形成減少，進(jìn)而導(dǎo)致OP。大量自噬小體在BMSCs分化初期被發(fā)現(xiàn)，抑制自噬將導(dǎo)致BMSCs凋亡，并減少其成骨分化[11-12]。成骨細(xì)胞來源于BMSCs，具有合成骨基質(zhì)并促進(jìn)骨基質(zhì)礦化的功能，Nollet等[12]發(fā)現(xiàn)自噬體可作為運(yùn)輸鈣磷結(jié)晶的載體，為成骨細(xì)胞發(fā)揮骨形成功能提供先決條件。并且，自噬還在各種不利環(huán)境下，對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[13-15]。最近，自噬相關(guān)miRNAs、lncRNAs和circRNAs作為關(guān)鍵因子，被認(rèn)為在BMSCs和成骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用。

2.1 促進(jìn)成骨分化和骨形成

部分自噬相關(guān)ncRNAs表現(xiàn)出對(duì)成骨分化的干預(yù)作用。Lu等[16]報(bào)道了lncRNA TUG1在骨形成中的作用，BMSCs成骨分化過程中TUG1表達(dá)明顯增加，通過阻斷AMPK通路和抑制自噬可以消除TUG1在BMSCs成骨分化中的積極作用，證明TUG1可以通過調(diào)控AMPK/mTOR自噬軸促進(jìn)BMSCs成骨分化，具有治療OP的潛力。Runt相關(guān)基因1(Runx1)被認(rèn)為是協(xié)調(diào)BMP和WNT信號(hào)通路來調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的成骨中心調(diào)節(jié)因子[17]。Ji等[18]觀察到circ_0026827表達(dá)在成骨分化過程中增加，而circ_0026827敲除則抑制人牙髓干細(xì)胞(DPSCs)成骨分化，并促進(jìn)miR-188-3p表達(dá)，而Runx1和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1是miR-188-3p的下游靶標(biāo)，表明circ_0026827通過海綿化miR-188-3p并靶向Runx1和Beclin-1介導(dǎo)的自噬促進(jìn)DPSCs成骨分化。

炎癥是導(dǎo)致骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的主要原因之一，表現(xiàn)為骨形成受損以及骨過度退化[19]。Dai等[20]用脂多糖(LPS)刺激人成骨細(xì)胞系MG63細(xì)胞以構(gòu)建炎癥模型，發(fā)現(xiàn)LPS刺激的MG63細(xì)胞中有427個(gè)差異表達(dá)基因，其中l(wèi)ncRNA NEAT1顯著下調(diào)，LPS上調(diào)炎性細(xì)胞因子和Nod樣受體蛋白3(NLRP3)表達(dá)，抑制自噬相關(guān)和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，而這一作用可被NEAT1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)，表明NEAT1通過激活自噬和抑制NLRP3炎性體來改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥并恢復(fù)其正常功能。

2.2 抑制成骨分化和骨形成

BMSCs成骨和成脂分化之間的轉(zhuǎn)變決定了骨量，在老年性O(shè)P中起重要作用[21]。Wu等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNA ZFAS1表達(dá)在成骨分化過程中下調(diào)，在成脂分化過程中上調(diào)，ZFAS1敲除則促進(jìn)成骨分化并抑制成脂分化，有效抑制細(xì)胞衰老并促進(jìn)自噬，其機(jī)制可能與通過海綿化miR-499，從而上調(diào)酪氨酸蛋白激酶A5受體(EphA5)表達(dá)有關(guān)。同樣，Long等[23]觀察到miR-223-3p的過表達(dá)將抑制下游靶點(diǎn)叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O3(FoxO3)表達(dá)，通過抑制自噬和成骨分化相關(guān)因子水平，抑制BMSCs的成骨分化。此外，先前的研究揭示了泛素特異性蛋白酶7(USP7)和組蛋白去甲基化酶(KDM6B)在成骨分化中的重要作用[24-25]。最近，Lu等[26]在OVX小鼠模型中觀察到miR-15b高表達(dá)，USP7和KDM6B低表達(dá)，注射miR-15b激動(dòng)劑后發(fā)現(xiàn)USP7表達(dá)降低并進(jìn)一步抑制KDM6B表達(dá)，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞自噬、增殖和分化受到抑制。另一方面，部分自噬相關(guān)ncRNAs還具有促進(jìn)BMSCs其他方向分化的能力。Zhang等[27]通過調(diào)節(jié)miR-9表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3數(shù)量、LC3Ⅱ/Ⅰ比值以及神經(jīng)元標(biāo)志物NSE和MAP2表達(dá)水平隨miR-9表達(dá)增加，表明當(dāng)miR-9過表達(dá)時(shí)自噬活性增加，BMSCs易于分化為神經(jīng)元細(xì)胞，而減少成骨分化。

自噬在各種應(yīng)激微環(huán)境(如炎癥、缺氧或氧化應(yīng)激)中維持著細(xì)胞存活。自噬失調(diào)則與人類疾病許多生理和病理過程有關(guān)，例如牙周炎組織中缺氧炎癥環(huán)境使得自噬過度激活，擾亂成骨和吸收之間的平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)流失[28]。Zheng等[29]發(fā)現(xiàn)circRNA CDK8和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)水平在牙周炎組織中顯著增加，在使用氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)的缺氧模型中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞標(biāo)志物(Runx2、ALP、OCN)表達(dá)水平在24～72 h內(nèi)顯著下降，此外，CDK8過表達(dá)通過mTOR信號(hào)誘導(dǎo)自噬和凋亡，CDK8沉默則逆轉(zhuǎn)了CoCl2對(duì)人牙周膜細(xì)胞(PDLSCs)成骨分化的抑制作用。因此，抑制過度自噬，恢復(fù)適度水平自噬是維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，可能在多種病理性骨質(zhì)流失的骨病中發(fā)揮重要作用。

3 自噬相關(guān)ncRNAs調(diào)控骨細(xì)胞作用機(jī)制

在成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換過程中，細(xì)胞空間位置和形態(tài)的劇烈變化需要細(xì)胞器的積極循環(huán)以提供營(yíng)養(yǎng)并適應(yīng)新環(huán)境[30]?？紤]到成熟骨細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞被動(dòng)分裂，需要細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制來保護(hù)它們免于經(jīng)歷細(xì)胞死亡[31]。同時(shí)，數(shù)十年的壽命決定了它們將長(zhǎng)期生存在低氧、高氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)匱乏和機(jī)械應(yīng)力的環(huán)境中。這些生物學(xué)證據(jù)強(qiáng)調(diào)了自噬是確保骨細(xì)胞在獨(dú)特微環(huán)境中存活的潛在機(jī)制。骨細(xì)胞是力學(xué)感受細(xì)胞，能夠感知機(jī)械力并轉(zhuǎn)化成梯級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)生生化變化[32]。周期性機(jī)械拉伸改變了骨細(xì)胞的大小和形狀，并促進(jìn)了骨細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)發(fā)育，這與上調(diào)的自噬有關(guān)[33]。最近幾年，人們才逐漸意識(shí)到骨細(xì)胞在調(diào)控骨代謝過程中的重要作用，這與很難獲得嵌入堅(jiān)硬礦化基質(zhì)中的骨細(xì)胞有關(guān)。目前，僅有一項(xiàng)研究[34]關(guān)注了自噬相關(guān)ncRNAs在骨細(xì)胞中的作用，然而該項(xiàng)研究?jī)H證明了過表達(dá)miR-199a-3p可以激活骨細(xì)胞樣MLO-Y4細(xì)胞中的自噬，其機(jī)制可能與抑制IGF-1/mTOR轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而并未確定miR-199a-3p是否調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝。期待更多的相關(guān)研究展開，為我們認(rèn)識(shí)骨細(xì)胞相關(guān)的骨發(fā)育、損傷、修復(fù)和再生過程提供幫助。

4 自噬相關(guān)ncRNAs調(diào)控破骨細(xì)胞作用機(jī)制

破骨細(xì)胞來源于單核造血系，主要受巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB配體受體激活劑(RANKL)的調(diào)控[35]。目前大量證據(jù)表明自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、ATG5、ATG7、LC3均在破骨細(xì)胞分化和生理功能上發(fā)揮著重要作用[36-38]。并且，破骨細(xì)胞骨吸收過程與miRNAs、lncRNAs和circRNAs表達(dá)的調(diào)控失調(diào)密切相關(guān)。因此，通過干預(yù)自噬相關(guān)ncRNAs從而抑制破骨細(xì)胞分化可能是治療OP的有效方向。

4.1 抑制破骨細(xì)胞分化

炎癥微環(huán)境在骨量丟失中起著關(guān)鍵作用，由于炎癥以細(xì)胞類型和組織特異性方式調(diào)控miRNAs組表達(dá)，炎癥誘導(dǎo)的miRNAs可能導(dǎo)致與炎癥相關(guān)的過度骨量丟失[39]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1結(jié)合蛋白2(TAB2)已被證明是一種新的Beclin-1相互作用分子，也是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1(TAK1)在自噬刺激下的共激活因子[40]。Sul等[39]發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中miR-155表達(dá)顯著升高，而過表達(dá)的miR-155降低TAB2表達(dá)使得Beclin-1從TAB2和Beclin-1的復(fù)合物中高效解離，并增加TAK1與復(fù)合物的結(jié)合，通過升高LC3Ⅱ水平和降低p62水平誘導(dǎo)自噬小體形成，從而增加破骨細(xì)胞形成和活性，證實(shí)miR-155通過靶向TAB2調(diào)控LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞自噬的新作用，抑制miR-155表達(dá)可作為一種治療靶點(diǎn)，通過抑制自噬抑制炎癥環(huán)境下破骨細(xì)胞分化。

缺氧常見于多種病理性骨質(zhì)流失的骨病中，通過抑制成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化能力來抑制骨形成，同時(shí)，由于缺氧后破骨細(xì)胞分化和活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨吸收亦增加[41]。而自噬作為缺氧等條件下細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，與破骨細(xì)胞分化和活性密切相關(guān)。Sun等[42]探索在M-CSF和RANKL刺激的RAW264.7細(xì)胞中缺氧對(duì)自噬和破骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)自噬和破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物(Nfatc1、Traf6和TRAP)表達(dá)，并抑制miR-20a的表達(dá)。當(dāng)過表達(dá)miR-20a后，其可以直接靶向Atg16L1從而抑制自噬，并顯著下調(diào)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)，證明miRNA-20a/Atg1L1軸可能是缺氧誘導(dǎo)破骨細(xì)胞自噬和分化的關(guān)鍵機(jī)制。

4.2 介導(dǎo)自噬相關(guān)信號(hào)通路影響破骨細(xì)胞分化

目前研究認(rèn)為，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是參與細(xì)胞自噬的中心通路[43]。mTOR作為自噬過程中的“監(jiān)控器”和“守門人”，直接參與調(diào)節(jié)自噬標(biāo)志蛋白的活動(dòng)，而PI3K/AKT軸作為其上游調(diào)節(jié)因子，能夠整合來自細(xì)胞環(huán)境的信號(hào)通路，最終參與調(diào)控自噬[44]。并且，mTOR作為破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵正向調(diào)節(jié)因子已被廣泛報(bào)道，而自噬可能通過mTOR途徑在骨吸收負(fù)性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。在Franceschetti等[45]研究中發(fā)現(xiàn)，mTOR和PI3K/AKT可能是miR-365和miR-99b的重要靶點(diǎn)，在小鼠骨髓破骨前體細(xì)胞中，抑制miR-365可以增加破骨細(xì)胞數(shù)量但降低其細(xì)胞體積，而抑制miR-99b則降低它們的數(shù)量和體積，因此miR-365和miR-99b可能在微調(diào)和整合mTOR信號(hào)以促進(jìn)最佳破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。見表1。

表1 自噬相關(guān)ncRNAs調(diào)控骨相關(guān)細(xì)胞作用機(jī)制Table 1 The mechanisms of autophagy-related ncRNAs regulating bone cells

5 小結(jié)與展望

OP逐漸成為老齡化社會(huì)主要負(fù)擔(dān)之一，雖然各種合成代謝藥物用于骨質(zhì)疏松治療，但存在的不良反應(yīng)和限制仍在不斷降低患者的生活質(zhì)量。鑒于ncRNAs和自噬在骨組織中重要生物學(xué)作用，確定自噬相關(guān)ncRNAs在OP中治療潛力是非常有必要的。通過文獻(xiàn)整理，我們發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)ncRNAs在BMSCs、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化、增殖、活性、凋亡中調(diào)節(jié)功能的有關(guān)研究明顯增多。然而，大部分研究集中在細(xì)胞模型，而在體內(nèi)進(jìn)行的研究很少，多數(shù)研究也是以自噬相關(guān)通路為媒介探討ncRNAs在OP中的作用，并未對(duì)自噬標(biāo)志蛋白進(jìn)行明確動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。lncRNAs和circRNAs都可以作為海綿直接結(jié)合miRNAs來影響OP進(jìn)程，有關(guān)lncRNAs和circRNAs參與OP的研究相對(duì)較新，特別是circRNAs與自噬的相互作用如何更好維持骨穩(wěn)態(tài)需要進(jìn)一步研究。例如，自噬相關(guān)circRNAs在骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用數(shù)據(jù)十分有限，但作為重要調(diào)節(jié)因子，其治療潛力是毋庸置疑的。此外，這些自噬相關(guān)ncRNAs在多種疾病中也同時(shí)發(fā)揮著特定的調(diào)控作用，因此，有必要探索它們與OP及其他器官疾病之間聯(lián)系的精確機(jī)制，這對(duì)于ncRNAs相關(guān)藥物在OP中的治療應(yīng)用具有重要意義。并且，盡管近期有大量研究探討了ncRNAs在OP進(jìn)展中的機(jī)制，但有關(guān)重要ncRNAs的臨床轉(zhuǎn)換研究仍然有限，在OP不同階段骨組織中差異表達(dá)ncRNAs的體內(nèi)研究也存在欠缺。骨質(zhì)疏松不同階段自噬水平也缺乏相應(yīng)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因此，識(shí)別更多與OP相關(guān)的重要ncRNAs，探索自噬、ncRNAs、OP的關(guān)系，開展有意義的臨床轉(zhuǎn)化研究，對(duì)于理解OP的病理機(jī)制、預(yù)防和治療具有重要意義。