雷蓉，周亞楠，白潔，蘇建，劉永利

河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院 河北省中藥質量評價與標準研究重點實驗室，河北 石家莊 050227

藥品質量的一致性是臨床有效性和安全性的重要保證。中成藥組方藥味多，成分復雜，如何進行一致性評價一直是中藥質量評價的關鍵問題，原輔料質量、藥品生產工藝參數(shù)和人員變動等因素都會影響到批間的一致性[1-2]。色譜指紋圖譜能較為全面地展現(xiàn)組方中各藥味的化學組成，在中藥質量的整體評價中作為一種較為成熟的技術得到廣泛應用?；瘜W模式識別技術主要包括主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLSDA）等，通過降維對指紋圖譜數(shù)據(jù)綜合分析，達到分類、識別并篩選質量差異標志物的目的。目前，色譜指紋圖譜結合化學模式識別已成為一種重要的中藥質量評價方式[3-21]。

四季三黃片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第二十冊，由大黃、黃芩、黃柏、梔子4 味中藥制成，具有消炎退熱、通便利水的功效，臨床上主要用于治療口鼻生瘡、咽喉腫痛、大便秘結、小便赤黃等癥[22]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了四季三黃片的指紋圖譜，指認了21 個共有峰，在指紋圖譜相似度評價的基礎上，結合化學模式識別技術分析評價了23 批來源于4 個不同生產企業(yè)的樣品質量與批間一致性，為四季三黃片整體質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超高壓液相-離子阱靜電場軌道阱質譜聯(lián)用儀（UPLC LTQ Orbitrap MS，配備Dionex UltiMate 3000 型UPLC 儀、LTQ-Orbitrap Elite 組合型高分辨質譜儀，美國Thermo 公司）；XPE26 型電子天平（0.001 mg）、XS105DU 型電子天平（0.01 mg）均購于瑞士Mettler-Toledo 公司；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品梔子苷（批號：110749-201919，純度：97.1%）、黃芩苷（批號：110715-201821，純度：95.4%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201212，純度：86.8%）、黃芩素（批號：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素（批號：111514-201706，純度：100.0%）、蘆薈大黃素（批號：110795-201710，純度：99.5%）、大黃酸（批號：110757-201607，純度：99.3%）、大黃素（批號：110756-201512， 度：98.7%）、漢黃芩苷（批號：112002-201702，純度：98.5%）、大黃酚（批號：110796-201922，純度：99.4%）、大黃素甲醚（批號：110758-201817，純度：99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；三氟乙酸（色譜純，天津化學有限公司）；水為超純水。23批四季三黃片抽自全國各地經營、使用單位，涉及4 家生產企業(yè)，其中A 企業(yè)樣品4 批次（S1～S4）、B企業(yè)樣品2批（S5～S6）、C企業(yè)樣品6批（S7～S12）、D企業(yè)樣品11批（S13～S23）。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu Shim-pack gist C18（100 mm×2.1mm，2 μm），以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，10%～15%A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～42%A；30～45 min，42%～75%A）；體積流量為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為254nm。UPLC LTQ Orbitrap MS分析過程以0.1%甲酸水溶液為流動相B，其余條件同上。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）噴霧電壓:+3.5 kV；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：10 arb；毛細管溫度：300 ℃；加熱器溫度：300 ℃；掃描方式：傅里葉變換高分辨全掃模式，數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS2，掃描范圍：m/z150～2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為0.08055、0.20330、0.05013、0.08887、0.03105、0.014 20、0.019 97、0.009 18、0.017 90、0.016 94、0.025 91 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取四季三黃片粉末0.4 g，精密稱定，放置到錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（700 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液（S9），按2.1.1 項下色譜條件進樣6 次，測定并分析數(shù)據(jù)，以4 號峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.19%，相對峰面積的RSD為0.17%～1.66%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批次的樣品（S9），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1.1 項下色譜條件測定并分析，以4 號峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.01%～0.11%，相對峰 面積的RSD 為0.41%～1.96%，表明方法的重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取編號S9 供試品溶液，分別在0、1、3、6、12、16、24 h 進樣測定并分析，以4 號峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.03%～0.23%，相對峰面積的RSD 為0.30%～2.18%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立和共有峰的指認 取23批四季三黃片的供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）對23批樣品的色譜圖進行分析，將S1樣品的色譜圖設為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，多點校正后自動峰匹配，標定了21 個共有峰，所有樣品的疊加圖見圖1，典型樣品和對照品色譜圖見圖2，其中11個峰采用對照品比對進行了確證，其余的10個共有峰采用LTQ Orbitrap 高分辨質譜技術進行指認，離子碎片信息見表1。共有峰中1 號峰來自于梔子，2、9、18 號峰來自黃柏，3～7、10～14 號峰均來自黃芩，15、16、19～21號峰來自大黃。

表1 四季三黃片正離子模式下的化合物鑒定及歸屬

圖1 23批四季三黃片的UPLC疊加圖

圖2 四季三黃片混合對照品和樣品的UPLC圖

2.4.2 相似度評價 對23批四季三黃片的指紋圖譜進行相似度分析，結果見表2。A 企業(yè)的樣品相似度均在0.979以上，B企業(yè)樣品相似度為0.869～0.944，C 企業(yè)樣品相似度為0.442～0.973，D 企業(yè)樣品相似度為0.730～0.933，表明4 家生產企業(yè)樣品質量差異較大，A、B、D 3家企業(yè)內不同批次樣品質量一致性較好，而C企業(yè)不同批次樣品質量一致性較差。

2.5 化學模式識別

2.5.1 HCA HCA 可以更直觀地展現(xiàn)樣品批間化學組分的差異性，利用OriginPro 2021軟件對21個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)HCA，結果見圖3。23批樣品按各生產企業(yè)聚為3類，A、D 企業(yè)各為一類，B、C企業(yè)聚為一類，

圖3 23批四季三黃片的HCA

2.5.2 PCA 采用SIMCA 12.0 軟件23 批樣品的21 個共有峰數(shù)據(jù)進行PCA，以主成分特征值及累積方差貢獻率進行篩選，通過繪制的得分圖與載荷圖對模型進行解釋，進一步應用Hotelling'sT2和DModX控制圖對樣品批間質量進行監(jiān)測。

模型擬合后共提取5 個主成分，累積方差貢獻率為93.7%，見表3。其中PC1和PC2累積方差貢獻率為70.4%，可以代表21 個共有峰的主要信息，繪制得分圖（圖4）、載荷圖（圖5）。由圖4 可知，23批樣品按不同企業(yè)分類明顯，與HCA 結果一致，表明不同企業(yè)間樣品一致性較差。載荷圖距離原點越遠的變量，權重越大，代表該化合物的含量對樣品的整體分布所起的作用越大。由圖5可知，C21（大黃素甲醚）、C2對PC1貢獻較大，C4、C6（黃芩苷）對PC2貢獻較大。

圖4 23批四季三黃片樣品的PCA散點得分

圖5 23批四季三黃片樣品的主成分載荷圖

表2 23批樣品的指紋圖譜相似度評價分析結果

表3 四季三黃片PCA特征值與累積方差貢獻率 %

2.5.3 Hotelling'sT2和DModX 控制限的建立 Hotelling'sT2和DModX控制圖用來監(jiān)測不同批次的產品的一致性，是2 個互補的多變量分析手段，可用于分析超出控制限批次產品的異常波動受哪些變量的影響[20]。Hotelling'sT2和DModX 的控制圖見圖6～7，圖中T2Crit（99%）和D Crit 為控制限，其上限分別為25.95、1.59；圖中的T2Crit（95%）為警戒限，上限為17.06。23 批樣品的波動范圍在均在控制限之下，為正常批次產品。

圖6 23批四季三黃片樣品的Hotelling's T2控制圖

2.5.4 PLS-DA 經過上述分析，雖然各批次產質量均在可控范圍內，未出現(xiàn)異常批次，但各企業(yè)間樣品分類明顯，為進一步篩選出導致23 批樣品產生差異的成分，采用OPLS-DA，利用變量重要性投影（VIP）值進行預測分析（圖8）。以VIP 值＞1 為標準，篩選出C18、C5、C10、C2、C19、C4、C6、C9、C7、C1、C21 11個化合物為引起樣品間差異的主要因素。其中影響較大的是C18、C5 和C10，其中C18 來源于黃柏，C5 和C10 來源于黃芩，提示生產企業(yè)應關注黃柏、黃芩投料的原藥質量。

圖7 23批四季三黃片樣品的DModX控制圖

圖8 四季三黃片的OPLS-DA的VIP值（, n=23）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

在供試品溶液制備方法考察時，分別考察了不同提取方式（超聲、回流）、不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、不同提取時間（15、30、45 min）、不同提取溶劑體積（25、50、100 mL）對四季三黃片中有效成分提取的影響，綜合色譜峰數(shù)量及響應值，確定采用70%甲醇超聲提取30 min 的方法。

在考察液相色譜條件時，分別考察了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%醋酸銨為流動相梯度洗脫，結果表明，乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脫呈現(xiàn)的色譜峰分離度良好，峰形最佳。并通過全波長掃描，樣品在254 nm 下色譜峰較多，且峰面積較大，故選擇了254 nm 作為檢測波長。

3.2 不同企業(yè)間樣品質量一致性分析

由相似度、PCA、HCA 結果可知，不同企業(yè)間樣品質量差異明顯，尤其C 企業(yè)與其他3 家差距大，通過進一步對篩選出來的3 個影響較大的差異標志性化合物C18、C5 和C10 原始數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)C 企業(yè)樣品中這3個化合物的相對含量均遠低于其他3個企業(yè)，表明C 企業(yè)所投黃柏、黃芩質量與其他3 家有較大差異，提示企業(yè)應關注這2種中藥的質量。

3.3 同一企業(yè)不同批次樣品質量一致性分析

由以上結果可知，A、B、D 3家企業(yè)內樣品質量一致性較好，而C企業(yè)內樣品批次間一致性較差，將其指紋圖譜數(shù)據(jù)進行PCA，模型擬合后共提取2個主成分，累積方差貢獻率為82.1%，將6 批樣品明顯沿PC1分成了兩類，其中S8、S12為一類，其余4批為一類，對分布貢獻較大的化合物為C4、C1、C2，其中C4 來源于黃柏，C1 來源于梔子，C2 來源于黃芩，S8、S12中3個化合物的相對含量均明顯低于其他批次，提示C 企業(yè)黃柏和黃芩原料的質量不穩(wěn)定，建議重點關注。

建立以質量一致性為核心的中成藥質量評價體系有利于促進中成藥質量的全面提升。本研究所建立的四季三黃片UPLC 指紋圖譜結合模式識別分析的方法可對四季三黃片的質量一致性進行評價，可為全面提升該產品質量提供參考。