符德靜，易紅，郭鳳倩，高慧敏，李春，閆利華，王萍，斯琴，劉曉謙*，王智民*

1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；

2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所/中藥質量控制技術國家工程實驗室，北京 100700

延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.又名頭頂一顆珠、芋兒七、獅兒七等，為百合科延齡草屬植物，是著名的恩施土家族四大神藥之一[1]，也是陜西“太白七藥”之一[2]。延齡草以干燥根及根莖入藥，其味甘，性平，有小毒，具有鎮(zhèn)靜安神、活血止血、消炎鎮(zhèn)痛、解毒等功效，主治頭暈目眩、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、高血壓和腦震蕩后遺癥等[3-6]。延齡草中含有多種有效成分，如甾體皂苷、倍半萜苷、黃酮、多糖等[7-8]。近年來關注最多是其甾體皂苷類成分，包括偏諾皂苷、薯蕷皂苷及延齡草烯苷等[9-11]，其中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（PRRG）和重樓皂苷Ⅵ均屬于偏諾皂苷，且是其中含量較高的成分。現(xiàn)代藥理學研究表明，偏諾皂苷具有止血[12]、鎮(zhèn)痛抗炎[13]、抗菌[14]、抗腫瘤[15]等作用，具有明確的藥用價值。因此，本研究旨在從延齡草中富集3 個主要偏諾皂苷獲得總皂苷，為延齡草總皂苷有效部位深入的藥效評價服務。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀、Multiskan Go 型酶標儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；N-1100 型EYELA 旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；HEP-100×60 型顎式破碎機（鶴壁市銀河分析儀器化工有限公司）；DET-50 型高速萬能粉碎機（溫嶺市大德中藥機械有限公司）；BT125D 型十萬分之一電子天平、BSA224S-CW 型萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）、JULABO SW22 型恒溫水浴振蕩器（優(yōu)萊博技術有限公司）；HWSY21-KP6 型電熱恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（杭州艾普儀器設備有限公司）；L530 型醫(yī)用離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；LDZX-50L-I型立式高壓蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；CKX41 型光學倒置顯微鏡（Olympus 公司）；MB100-2A 型微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品重樓皂苷Ⅶ（P1，批號：DSTDC003001，純度≥98%）、PRRG（P2，批號：DSTDP005701，純度≥98%）、重樓皂苷Ⅵ（P3，批號：DSTDC002901，純度≥98%）均購自四川成都德思特生物科技有限公司；色譜甲醇、乙腈（美國Fisher 公司）；95%乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；HPD300、HPD400、HPD600 型大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩吸附材料有限公司）；SP825l、SP700、SP70 大孔吸附樹脂（日本三菱化學公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；胎牛血清（批號：2168090RP）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：02221008）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號：8121475）、0.25%胰蛋白酶（批號：2276965）均購自美國Gibco 公司；脂多糖（LPS，批號：L2880，美國Sigma 公司）；噻唑藍（MTT，北京京匯科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海麥克林生化科技有限公司）；HyClone SV30010 青鏈霉素（雙抗）混合液（美國Cytiva公司）。

延齡草藥材購自湖北巴東一零八藥材種植專業(yè)合作社，經(jīng)中國科學院昆明植物所李恒研究員鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖。

1.3 細胞

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法與結果

2.1 延齡草總皂苷的含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件 參考文獻[16]方法對其色譜條件適當微調，調整后的方法：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～26 min，30%～40%A；26～45 min，40%～41%A）；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。高效液相色譜法（HPLC）圖譜見圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ混合對照品和延齡草樣品的HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ對照品適量[17]，精密稱定，加甲醇配置成質量濃度分別為0.098 4、0.587 0、0.829 0 mg·mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 藥材含量測定用樣品：稱取延齡草根莖粉末（過50 目篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。經(jīng)測定所收集的延齡草藥材的總皂苷的質量分數(shù)以3個皂苷質量分數(shù)之和計為4.97%?？傇碥仗崛∥飿悠罚悍Q取延齡草總皂苷提取物粉末（過80目篩）15 mg，精密稱定，甲醇定容至10 mL 即得延齡草總皂苷提取物供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 取2.1.2 項下混合對照品溶液，用甲醇分別稀釋1、2、10、12.5、20、25倍，配制成系列質量濃度的混合對照品進樣，以對照品質量濃度為橫坐標（X）與峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。得到重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ的線性回歸方程：YP1=45.358 0X+0.010 4（r=0.999 9）、YP2=55.466 0X+0.018 4（r=1.000 0）、YP3=65.624 0X+0.004 1（r=1.000 0），重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ分別在0.004 0～0.098 4、0.023 0～0.587 0、0.033 0～0.829 0 mg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.2 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 7 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析和雙側t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 提取工藝

2.3.1 提取溶劑的單因素考察 對提取溶劑進行單因素考察，選取50%、75%、95%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，提取1 h。提取溶劑為50%乙醇、75% 乙醇、95% 乙醇的提取率分別為（80.81±0.88）%、（88.25±1.47）%、（85.31±0.44）%，結果表明75%乙醇提取效果最佳。

2.3.2 正交試驗設計 根據(jù)文獻[18]及單因素考察結果，確定提取溶劑為75%乙醇，選取液料比（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）作為提取工藝的考察因素，以延齡草總皂苷提取率為考察指標。稱取延齡草藥材（過50 目篩）9 份，每份20 g。因素水平及結果見表1～3。由結果可知，對延齡草總皂苷提取率影響順序為C＞A＞B。因素A 和因素B 為不顯著因素，因素C 各水平對延齡草總皂苷的提取率影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜合以上結果，正交試驗所得的最優(yōu)工藝為A3B2C3，即75%乙醇，液料比為12∶1，提取3 次，每次90 min?？紤]液料比對提取率影響不大，從節(jié)約溶劑的角度，調整液料比為10∶1；隨著提取次數(shù)的增加，提取率逐漸增大，但提取2次和提取3次時延齡草總皂苷提取率增加不明顯，且提取次數(shù)的增加會導致能耗增加，故將提取次數(shù)調整為2 次，即最優(yōu)工藝為以75%乙醇為提取溶劑，按液料比10∶1 加入提取溶劑，加熱回流提取2次，每次1.5 h。

表1 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗因素水平

2.3.3 驗證實驗 按優(yōu)選的最佳提取工藝進3 批驗證實驗，延齡草總皂苷提取率分別為88.57%、87.72%、89.44%，均值為88.58%，3 批結果較為一致，表明此工藝條件穩(wěn)定可行。

2.4 大孔樹脂純化富集工藝

2.4.1 提取液的制備 取延齡草根莖粉末100 g，按最佳工藝進行提取，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，生藥質量濃度為0.1 g·mL-1即為延齡草提取液。

2.4.2 大孔樹脂型號篩選 稱取經(jīng)預處理后各型號（HPD300、HPD400、HPD600、SP70、SP700、SP825l）大孔吸附樹脂各2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入延齡草提取液50 mL（揮至無醇味后，加水定容至藥液質量濃度為0.1 g·mL-1），于恒溫水浴振蕩器（25 ℃、120 r·min-1）中持續(xù)振蕩24 h 使其達到吸附平衡，濾過，取濾液定容至100 mL，得吸附后的溶液，測定溶液中3個主要皂苷的含量，計算得到各型號樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率。將達到飽和吸附的各型號樹脂濾出后分別另置100 mL 錐形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，在相同條件下恒溫振蕩24 h，進行解吸附，濾過，濾液定容至100 mL，得解吸后的溶液，測定延齡草總皂苷含量，計算各型號樹脂的解吸率和轉移率，結果見表4。綜合各型號樹脂的靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)，以轉移率［按公式（1）計算］為綜合評分指標，SP700和HPD400型樹脂轉移率均較高，鑒于樹脂價格考量，選擇HPD400 型樹脂進行純化。

特殊地，當部件任務ti,,tk可并行執(zhí)行時，將其視為一個虛擬任務tg，tg=ti∪∪tk。根據(jù)式(24)和定義2，若數(shù)據(jù)快照為tg對應的信息，則將任務對應的物料、工藝、質量節(jié)點關聯(lián)起來，有

表2 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗設計結果

表3 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗方差分析結果

表4 各型號樹脂延齡草皂苷的靜態(tài)吸附率、解吸率及轉移率結果 %

2.4.3 上樣量和上樣流速的考察 量取5 份經(jīng)預處理的HPD400 型大孔樹脂30 mL，分別裝于5 根色譜柱（內徑1.5 cm，高35 cm，樹脂徑高比約1∶10）中，分別以1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 BV·h-1流速進行上樣，分段收集流出液，每個柱體積為1 個流分，共收集10 BV，測定各上樣流出液中延齡草總皂苷的含量，并繪制泄漏曲線。由圖2可知，以1 BV·h-1流速上樣總皂苷泄漏點出現(xiàn)最晚，表明其吸附量最多，因此選擇1 BV·h-1為上樣流速。此時上樣體積為5 BV時，即折合生藥量15 g時開始出現(xiàn)泄漏，說明樹脂已經(jīng)達到吸附飽和，因此最大上樣量定為藥材-樹脂（1∶2），藥液質量濃度為0.1 g·mL-1。

圖2 延齡草總皂苷泄漏曲線

2.4.4 洗脫溶劑的考察 取HPD400 型大孔樹脂30 mL，裝于色譜柱中，以1 BV·h-1流速進行上樣，上樣量為150 mL 藥液［質量濃度為0.1 g·mL-1（生藥）］。上樣吸附完成后，依次用水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫溶劑用量均為3 BV，再分別用6 BV 的50%、60%、70%、95%乙醇進行梯度洗脫，收集洗脫液。每個柱體積為1 個流分，測定各流分中延齡草總皂苷的含量及浸膏含量。由圖3 結果可知，總皂苷主要集中在50%～70%乙醇洗脫部位，3 個部位總皂苷洗脫率之和達90%以上，由表5 可知，以50%乙醇及60%乙醇部位含量較高，為保證總皂苷收率，最終純化工藝定為上樣完畢后，以20%乙醇洗脫除去雜質，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液。

表5 各洗脫部位延齡草總皂苷質量分數(shù)及浸膏量

圖3 各洗脫部位延齡草總皂苷的洗脫率變化

2.4.5 洗脫流速和洗脫體積的考察 量取3份HPD400型大孔樹脂30 mL，裝于色譜柱中，以1 BV·h-1流速進行上樣，上樣量為生藥（g）∶樹脂（mL）為1∶2。上樣吸附完成后，用3 BV 的20%乙醇洗脫，除去雜質，收集70%乙醇洗脫部位，共收集10 BV，洗脫流速分別為1、2、3 BV·h-1流速，分段收集洗脫液，每1 BV（30 mL）為1 個流分，共收集10 份，測定各流分中延齡草總皂苷的含量，計算洗脫率。由圖4 可知，當洗脫溶劑用量達5 BV 時各組樣品的總皂苷均基本洗脫完全，因此洗脫劑用量定為5 BV。為節(jié)約時間和提高洗脫效率，洗脫流速定為3 BV·h-1。

圖4 不同流速下延齡草各流分的洗脫率變化

2.4.6 驗證實驗及中試放大試驗 按優(yōu)化的純化工藝進行放大10 倍驗證實驗，延齡草總皂苷的質量分數(shù)為35.16%，收率為8.04%，說明該純化工藝穩(wěn)定可行。開展了50 kg級的中試放大試驗，結果與驗證實驗的結果基本一致，20%乙醇洗脫部位幾乎不含皂苷成分，說明能夠將有效部位保留且除掉其他雜質；70%乙醇洗脫部位延齡草總皂苷的質量分數(shù)為34.29%，收率為7.42%。逐級放大實驗的結果與實驗室工藝一致，表明工藝具備放大的可行性，方法穩(wěn)定、可控。

2.5 延齡草總皂苷提取物的抗炎活性

2.5.1 樣品的制備 取延齡草醇提物（CT，收率為38.10%，總皂苷質量分數(shù)為10.10%）及樹脂純化物（CH，收率為7.42%，總皂苷質量分數(shù)為34.29%），分別精密稱取上述2 種提取物適量，用DMSO 溶解，配制成質量濃度為100 mg·mL-1的儲備液，于冰箱4 ℃保存（實驗時用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液稀釋成不同的質量濃度，DMSO終體積分數(shù)不超過0.1%）。

2.5.2 MTT 法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，按細胞密度1×105個/mL，每孔100 μL 接種于96孔板中，分為空白組和實驗組，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，實驗組加入用完全培養(yǎng)基配制好的不同質量濃度（50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg·mL-1）的CH和CT藥液10 μL，每個質量濃度設置3個復孔，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基，隨后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。給藥孵育后，每孔中加入MTT 10 μL（避光加入），置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄孔內培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 溶解結晶，置于酶標儀中，在570 nm 波長[19-21]下測定吸光度（A）值，按公式（2）計算細胞存活率。

細胞存活率＞90%可認為無細胞毒性，圖5 結果表明，CT 組在25.00～0.05 μg·mL-1與細胞共培養(yǎng)24 h 無明顯毒性，CH 組在5.00～0.05 μg·mL-1與細胞共培養(yǎng)24 h 無明顯毒性，因此兩組可分別在無細胞毒性的質量濃度下進行后續(xù)實驗研究。

圖5 延齡草CH和CT對RAW264.7細胞活力的影響（,n=3）

由圖6可知，與空白組相比，LPS模型組能顯著增加NO的釋放量，說明LPS誘導RAW264.7細胞炎癥模型制備成功。與LPS模型組相比，CT組僅在25 μg·mL-1的質量濃度下對NO的釋放表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P＜0.000 1）；CH組在5.00、1.00 μg·mL-1的質量濃度下均對NO 的分泌有顯著的抑制作用（P＜0.000 1，P＜0.05）。延齡草CT 得率為38.10%，延齡草CH 得率為7.42%，說明經(jīng)樹脂純化后，其抗炎效果明顯提升。

圖6 延齡草CH和CT對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響（, n=5）

3 討論

LPS 誘導RAW264.7 細胞產生多種炎癥細胞因子，是經(jīng)典的篩選抗炎藥物的炎癥模型，被廣泛用于藥物體外抗炎研究。NO是各種炎癥介質之一，參與介導細胞免疫和炎癥毒性反應，在調節(jié)多種生理功能方面起重要作用，如擴張血管、神經(jīng)傳遞和炎癥應答等。以LPS激活RAW264.7巨噬細胞炎癥信號通路，在細胞培養(yǎng)液中釋放產生大量NO，加劇炎癥反應，此時通過藥物進行干預，NO濃度的變化可以用來評價藥物抑制炎癥反應的強弱。CH和CT均可抑制LPS誘導的NO 的釋放，在1.00～5.00 μg·mL-1藥物質量濃度，CH組的抑制作用呈劑量依賴性，可顯著抑制NO 的釋放，其IC50值為3.79 μg·mL-1，而CT 組的IC50值為20.68 μg·mL-1，其效果與純化前相比明顯提升。

在樹脂純化工藝優(yōu)化過程中，考慮到70%洗脫部位總皂苷含量仍偏低，曾嘗試將除雜溶劑的乙醇體積分數(shù)提高至30%，但70%洗脫部位總皂苷含量并未提高，且收率反而明顯下降，故仍選擇了20%乙醇洗脫雜質。

本研究對優(yōu)化的提取、純化工藝進行了逐級放大工藝驗證，證明了工藝的穩(wěn)定性、可靠性，經(jīng)提取、純化得到的延齡草總皂苷純度較高，工藝穩(wěn)定、可控。

延齡草中的偏諾皂苷含量遠高于其同屬植物重樓[22-23]，兩者在傳統(tǒng)應用習慣中也較為相似，相比重樓，延齡草作為一種量大、易得的藥材具有更為廣闊的發(fā)展前景。本研究基于延齡草皂苷確切的抗炎活性，開展適合于工業(yè)化生產的延齡草抗炎有效部位的提取、純化工藝研究，為推動延齡草的發(fā)展提供支撐。