李 娜 ,田 芳 ,曲 栗 ,錢昌麗 ,高 琴 ,韓 麗 ,趙艷榮,王 玉?

(1.蘭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,蘭州 730000;2.雅培營養(yǎng)中國研發(fā)中心,上海 200233;3.上海海關(guān) 動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心,上海 200135)

母乳作為極好的蛋白質(zhì)來源,可提供嬰兒所需的氨基酸,包含必需氨基酸、非必需氨基酸和其他氨基酸。必需氨基酸包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸及色氨酸等9種,其不能由嬰兒自身合成,需要通過食物供給,具有促進嬰兒組織蛋白質(zhì)合成、參與其他氨基酸代謝轉(zhuǎn)換、促進嬰兒早期腸道成熟等重要作用[1]。非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸和絲氨酸等8種,可通過自身合成也可從其他氨基酸轉(zhuǎn)化獲取。除此之外,母乳中還含有胱氨酸、牛磺酸等其他氨基酸。母乳中氨基酸對嬰兒早期生長發(fā)育有重要作用,準確定量分析母乳中氨基酸意義重大。

目前,氨基酸的檢測方法主要有氨基酸分析法、柱前衍生-液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法等[2],其中氨基酸分析法[3-8]和柱前衍生-液相色譜法[9-12]應(yīng)用較多,但均不能用于檢測色氨酸。氨基酸分析法的樣品處理步驟簡單、方法成熟,但分析時間長、儀器購買及維護成本高,相關(guān)國家標準(簡稱GB 法)為GB 5009.124－2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[13],該標準可檢測除了色氨酸和胱氨酸以外的16種氨基酸,但蛋氨酸檢測容易受到母乳基質(zhì)中雜質(zhì)峰的干擾[14]。柱前衍生-液相色譜法雖然樣品處理復(fù)雜,但是分析快速、靈敏度高、可選衍生試劑種類多、儀器通用性強,在不具備氨基酸分析儀的條件下也可以用于氨基酸含量的測定。柱前衍生-液相色譜法應(yīng)用較廣泛的衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)、異硫氰酸苯酯(PITC)、二硝基氟苯(DNFB)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)等。其中,OPA 衍生反應(yīng)快速,但只能與一級氨基酸反應(yīng),不能直接與二級氨基酸反應(yīng);PITC毒性大,需要連接真空蒸發(fā)衍生裝置;DNFB、FMOC-Cl、Dansyl-Cl的衍生副產(chǎn)物會干擾測定結(jié)果;AQC可以同時檢測一、二級氨基酸,具有衍生時間短、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、帶有的6-氨基喹啉基團(AMQ)可被檢測、不干擾其他氨基酸定量檢測等優(yōu)點[15],成為液相色譜法廣泛使用的衍生試劑。文獻[16]以AQC衍生,附紫外檢測器的柱前衍生-超高效液相色譜法(簡稱AOAC 法)同時測定嬰兒配方食品中除色氨酸以外的18種氨基酸(包含蛋氨酸、胱氨酸和牛磺酸)的含量。以上兩種方法在母乳基質(zhì)中的應(yīng)用及比對分析研究較少,文獻[14]進行了兩種方法的比對試驗,但其所使用的前處理方法與GB法的一致,且沒有考慮不同泌乳階段母乳樣品中氨基酸的差異。鑒于此,本工作參考AOAC 法,并根據(jù)基質(zhì)特點優(yōu)化了柱溫,以柱前衍生-超高效液相色譜法測定母乳中16種氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸和?；撬?的含量,并與GB法比對,以期為母乳中氨基酸含量的準確測定推薦適用的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色譜儀,配紫外檢測器;OGS180型烘箱、G560E 型渦旋儀;FB15061型超聲儀;ER-35S 型恒溫加熱板;5190-5269型0.2μm 尼龍針頭過濾器;EFAA-DC24-RT型氮吹儀;XPE 205型電子天平;MS 304S/01型電子天平;MS 3002TS/02 型電子天平;Milli-Q Advantage A10型超純水儀。

17 種氨基酸混合標準儲備溶液:編號為AAS18,胱氨酸的質(zhì)量濃度為1.25 mmol·L－1,其他16種氨基酸的質(zhì)量濃度均為2.50 mmol·L－1。

牛磺酸標準儲備溶液:2.5 mmol·L－1,取適量?；撬針藴势?用水稀釋并定容至100 mL 容量瓶中。

混合標準溶液系列:參考 AOAC 法,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液逐級稀釋17種氨基酸混合標準儲備溶液和?；撬針藴蕛淙芤?配制成濃度為0.5,1,5,10,25μmol·L－1(胱氨酸濃度為0.25,0.5,2.5,5,12.5μmol·L－1)的混合標準溶液系列。

L-正纈氨酸內(nèi)標溶液:10 mmol·L－1,取適量L-正纈氨酸標準品,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液稀釋并定容至100 mL容量瓶中。

AQC衍生試劑:取Acc Q·Fluor衍生試劑盒中2B試劑(乙腈)1 mL,置于2A 試劑(AQC)瓶中,輕彈2A 試劑瓶中,使粉末落至瓶底,渦旋10 s后放置在55℃恒溫加熱板上加熱10 min至完全溶解,干燥密封保存,有效期一周。

AccQ · Fluor 氨基酸衍生試劑盒套裝(WAT052880),其中包含Buffer試劑(硼酸鹽緩沖液)瓶、2A 試劑瓶和2B試劑瓶;L-正纈氨酸標準品純度不小于99%;?；撬針藴势芳兌炔恍∮?9.5%;甲酸銨純度不小于96.5%;甲酸為質(zhì)譜純;乙腈為色譜純;苯酚、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純;試驗用水為超純水,電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器工作條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱 溫60 ℃;流 量0.4 mL·min－1;進樣量1μL;檢測波長260 nm;流動相A 為體積比85∶15水和濃縮液(體積比84∶11∶5 的200 mmol·L－1甲酸銨-乙腈-甲酸混合液)的混合液;流動相B 為1.3%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～5.50 min時,A 為99.9%;5.50～15.22 min 時,A 由99.9%降 至90.9%;15.22～20.47 min時,A 由90.9%降 至78.8%;20.47～21.26 min時,A 由78.8%降 至40.4%;21.26～21.29 min時,A 由40.4% 降 至10.0%,保 持1.55 min;22.84～26.00 min 時,A 由10.0%升 至99.9%,保持6.00 min。

1.3 試驗方法

母乳經(jīng)室溫解凍完全融化后,渦旋或超聲至充分混勻。分取0.22 mL 至螺紋頂空瓶中,依次加入水0.88 mL、0.2 mol·L－1氫氧化鈉溶液0.6 mL、0.2 mol·L－1鹽酸溶液0.6 mL、L-正纈氨酸內(nèi)標溶液0.2 mL、含0.1%(體積分數(shù))苯酚的12 mol·L－1鹽酸溶液2.5 mL,氮吹5 s后蓋緊瓶蓋,渦旋混勻,放入110 ℃烘箱中水解(24±0.5)h,取出冷卻至室溫。從液面下1 cm 處取0.2 mL 水解樣品,加入6 mol·L－1氫氧化鈉溶液0.2 mL和0.1 mol·L－1鹽酸溶液0.4 mL,渦旋混勻后過0.2μm 尼龍針頭過濾器。取AccQ·Fluor衍生試劑盒中Buffer試劑70μL至微量離心管中,加入上述濾液10μL,邊渦旋邊加AQC衍生試劑20μL,過程持續(xù)2～3 s后,迅速合上蓋子,室溫放置1 min,放入55 ℃烘箱,加熱10 min,取出冷卻后按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

柱溫對基線的穩(wěn)定性影響較大,因此試驗比較了柱溫分別為50,55,60 ℃時基線的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:柱溫為50,55℃時,苯丙氨酸的色譜峰基線不平穩(wěn);升高柱溫至60 ℃時,苯丙氨酸的色譜峰基線平穩(wěn)。因此,試驗選擇的柱溫為60 ℃。

在優(yōu)化的試驗條件下,25μmol·L－1含內(nèi)標的混合標準溶液(內(nèi)標物濃度為10μmol·L－1)以及樣品溶液的色譜圖見圖1。樣品溶液中天冬氨酸的濃度為天冬氨酸和天冬酰胺濃度總和,谷氨酸的濃度為谷氨酸和谷氨酰胺濃度的總和。

圖1 氨基酸的色譜圖Fig.1 Chromatograms of amino acids

結(jié)果顯示,含內(nèi)標的混合標準溶液和樣品溶液中18種氨基酸可完全分離,但是在采用本方法分析實際樣品中胱氨酸和蛋氨酸時,二者不能實現(xiàn)完全分離。試驗曾嘗試采用添加3,3′-二硫代二丙酸,將胱氨酸轉(zhuǎn)化成S-2-羧乙基硫代半胱氨酸后再定量分析[15,17],但并不適用于本方法,具體原因還待進一步研究。

2.2 標準曲線和檢出限

按照試驗方法衍生和測定混合標準溶液系列,以各氨基酸的濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示,17 種氨基酸標準曲線的線性范圍為0.5～25μmol·L－1,胱氨酸標準曲線的線性范圍為0.25～12.5μmol·L－1,其他線性參數(shù)見表1。

按照試驗方法衍生并重復(fù)測定0.5μmol·L－1混合標準溶液10次,以3倍標準偏差(s)計算檢出限(3s),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

表1 (續(xù))

2.3 精密度和回收試驗

按照試驗方法對同一母乳樣品在3 d 內(nèi)進行6次檢測,計算測定值的相對標準偏差(RSD);對該樣品進行低、中、高等3個加標水平的回收試驗,計算回收率。結(jié)果顯示,胱氨酸和蛋氨酸測定值的RSD 分別為15%和57%,胱氨酸回收率為79.6%,精密度和回收率均不符合方法性能要求,不推薦采用該方法檢測這兩種物質(zhì),其他16種氨基酸的精密度和回收試驗結(jié)果見表2。

由表2可知,16種氨基酸的回收率為95.0%～108%,測定值的RSD 均不大于9.0%,表現(xiàn)出了良好的準確度和精密度。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.4 方法比對

選擇不同泌乳階段的母乳樣品各6份,分別是1～5 d的初乳、10～15 d的過渡乳、40～400 d的成熟乳(包括40～45 d的早期成熟乳、200～240 d的中期成熟乳、300～400 d的晚期成熟乳)的母乳(以嬰兒出生為起點),分別用本法和GB法檢測其中的15種氨基酸,并采用SPSS 23.0軟件對兩種方法的測定值進行配對樣本t檢驗,結(jié)果見表3。其中“?”表示同一泌乳階段兩種方法的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 方法比對結(jié)果Tab.3 Results of method comparison mg/100 mL

結(jié)果顯示:除了成熟乳中的組氨酸外,本法測得各氨基酸的含量均高于GB 法的,大部分氨基酸的測定值具有顯著性差異(P＜0.05),差異顯著程度由大到小依次為初乳、過渡乳和成熟乳,說明測定值的差異和母乳樣品中蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。如初乳和過渡乳中除組氨酸及精氨酸外的其他氨基酸的測定值與GB法的相對誤差均大于19%,成熟乳中除組氨酸、精氨酸及賴氨酸以外的相對誤差均大于11%,這與文獻[14]的相對誤差(小于4.7%)相差較大。推測主要原因:①本法采用的超高效液相色譜儀和氨基酸分析儀與文獻[14]不同;②文獻[14]中前處理方法和GB法的一致,與本法相差較大;③本法的取樣量(0.22 mL)和GB法的(0.5 mL)不同,GB法取樣量較大,可能出現(xiàn)因母乳中蛋白質(zhì)水解不充分導(dǎo)致的氨基酸測定值偏低的現(xiàn)象。

為了驗證本法測定值的準確度,又進行了文獻對比。結(jié)果顯示,本法所得成熟乳中的測定結(jié)果與文獻[10]用OPA/FMOC-Cl柱前衍生-高效液相色譜法所得中國3個城市1～2月、4～8月母乳測定值基本一致,與使用AQC 柱前衍生-高效液相色譜法所得9國30～60 d母乳測定值也基本一致[9],但本法所得初乳、過渡乳中氨基酸測定值均高于同樣使用AQC柱前衍生-高效液相色譜法所得中國7個城市3～6 d、10～13 d母乳中氨基酸的測定值[12],這可能與母乳的采樣時間有關(guān),因為泌乳早期母乳中氨基酸含量受哺乳時間的影響較大[9-10,18],具體原因還待進一步驗證。

基于AOAC法,本工作采用AQC柱前衍生-超高效液相色譜法快速、準確測定母乳中16種氨基酸的含量,該方法具有良好的精密度和準確度,與GB法測定結(jié)果有一定差異,具體原因還待進一步驗證。