楊 飛 ,紀(jì) 元 ,王 穎 ,范子彥 ,唐綱嶺?

(1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,鄭州 450001;2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,濟(jì)南 250101)

環(huán)孢素A 和他克莫司均是臨床上經(jīng)常使用的強(qiáng)效免疫抑制劑,在服藥后,血藥濃度水平與免疫抑制程度以及肝腎毒性密切相關(guān)。環(huán)孢素A 和他克莫司的治療窗口狹窄,環(huán)孢素A 的推薦治療血藥質(zhì)量濃度在術(shù)后1個(gè)月內(nèi)為250～450μg·L－1,1～3個(gè)月內(nèi)為250～400μg·L－1,3～6 個(gè)月內(nèi)為180～400μg·L－1,6～12個(gè)月內(nèi)為150～300μg·L－1,12個(gè)月后為100～250μg·L－1[1];他克莫司的推薦治療血藥質(zhì)量濃度在術(shù)后1個(gè)月內(nèi)為15～20μg·L－1,2～3個(gè)月內(nèi)為10～15μg·L－1,3個(gè)月后為5～10μg·L－1[2]。因此,需要對患者的血藥濃度水平進(jìn)行監(jiān)測,進(jìn)而根據(jù)患者自身情況調(diào)整免疫抑制劑的用量[3-4]。

血液中環(huán)孢素A 和他克莫司的檢測方法主要有免疫分析法[5-6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-13]。免疫分析法試劑昂貴、操作繁瑣,且無法同時(shí)分析兩種及兩種以上藥物。HPLC 耗時(shí)較長,不適用于大規(guī)模臨床樣本的檢測。LC-MS/MS的選擇性高,是分析免疫抑制劑的常用方法,已廣泛應(yīng)用于血液中環(huán)孢素A 和他克莫司的檢測。血液基質(zhì)復(fù)雜,含有大量的脂類、蛋白質(zhì)等,在采用LC-MS/MS 測定前,需要通過固相萃取等方法凈化[10,14]。PRi ME HLB通過式固相萃取柱是一種新型的親水親油平衡固相萃取柱,不需要活化、清洗柱子等步驟即可在重力作用下凈化樣品[15-18],但是尚未發(fā)現(xiàn)它在人全血中環(huán)孢素A 和他克莫司檢測中的應(yīng)用。為此,本工作以PRiME HLB 通過式固相萃取柱凈化樣品,以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定人全血中環(huán)孢素A 和他克莫司的含量,方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確,靈敏度高且特異性強(qiáng),適用于實(shí)驗(yàn)室中大批量樣品的快速檢測。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜儀,配二元輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和脫氣機(jī);API 4000型三重四極桿質(zhì)譜儀;5810R 型低溫離心機(jī);Vortex-genie 2型旋渦混合器;BSA2245S-CW 型電子天平;Milli-Q型超純水系統(tǒng);針筒式過濾器,配0.22μm 有機(jī)相濾膜;PRi ME HLB 通過式固相萃取柱(1 mL/30 mg)。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:環(huán)孢素A-d4和他克莫司-13C,d2質(zhì)量濃度分別為5,0.5 mg·L－1,介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:環(huán)孢素A 和他克莫司的質(zhì)量濃度分別為200.0,10.0 mg·L－1,介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別取5,25,100,250,500,1 000μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于6個(gè)10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋,得到環(huán)孢素A 的質(zhì)量濃度分別為0.1,0.5,2.0,5.0,10.0,20 mg·L－1,他克莫司的質(zhì)量濃度分別為5,25,100,250,500,1 000μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取180μL人空白全血至1.5 mL離心管中,加入20μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,得到環(huán)孢素A 的質(zhì)量濃度分別為10,50,200,500,1 000,2 000μg·L－1,他克莫司的質(zhì)量濃度分別為0.5,2.5,10,25,50,100μg·L－1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

質(zhì)控溶液:分別取40,200,800μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到低、中、高濃度水平的質(zhì)控溶液,其中環(huán)孢素A的質(zhì)量濃度為0.8,4.0,16 mg·L－1,他克莫司的質(zhì)量濃度為40,200,800μg·L－1。

環(huán)孢素A、他克莫司、環(huán)孢素A-d4和他克莫司-13C,d2標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99.0%(規(guī)格均為0.1g);甲醇、乙腈均為色譜純;甲酸和乙酸銨的純度均大于98.0%;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm);柱溫60 ℃;進(jìn)樣量10μL;流量1.0 mL·min－1;流動相A 為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的0.01 mol·L－1乙酸銨溶液,B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～0.50 min,A 由35%降 至5%,保 持3.50 min;4.00～4.01 min,A 由5%跳轉(zhuǎn)至35%,保持2.99 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)掃描模式,電壓5 500 V;離子源溫度400 ℃;氣簾氣壓力137.9 kPa,輔助加熱氣壓力344.7 kPa,碰撞氣壓力41.4 k Pa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“?”代表定量離子對。

1.3 試驗(yàn)方法

取200μL人全血樣品,置于1.5 mL離心管內(nèi),加入20μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,混勻。加入300 mmol·L－1硫酸鋅溶液200μL,渦旋60 s,加入600μL 乙腈,渦旋120 s,靜置5 min,待蛋白沉淀完全,以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min。分取上清液約1 mL,注入PRi ME HLB通過式固相萃取柱。收集流出液,按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

離子源溫度對環(huán)孢素A 的電離效果影響顯著,離子源溫度過高時(shí),環(huán)孢素A 的質(zhì)譜響應(yīng)值明顯降低,因此試驗(yàn)考察了離子源溫度分別為350,400,450,500℃時(shí)對環(huán)孢素A 和他克莫司質(zhì)譜響應(yīng)值的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1 可知,和其他溫度相比,離子源溫度為400 ℃時(shí)環(huán)孢素A 和他克莫司響應(yīng)值均較高,因此試驗(yàn)選擇的離子源溫度為400 ℃。

試驗(yàn)比較了ESI＋和電噴霧離子源負(fù)離子(ESI－)掃描模式下2種目標(biāo)物的響應(yīng)值。結(jié)果顯示,ESI＋掃描模式下環(huán)孢素A 及他克莫司響應(yīng)值和穩(wěn)定性均較高,這是由于環(huán)孢素A 及他克莫司分子結(jié)構(gòu)中均有含氮基團(tuán),易在ESI＋模式下電離得到母離子[M＋H]＋、[M＋NH4]＋。以[M＋NH4]＋為前體離子,繼續(xù)在ESI＋模式下進(jìn)行m/z200～1 250以內(nèi)的產(chǎn)物離子掃描,優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量,選擇穩(wěn)定性強(qiáng)、響應(yīng)值高的2個(gè)碎片離子對分別作為定量、定性離子對,所得質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)比較了ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,3.5μm)、Eclipse Plus-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm)、Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)對環(huán)孢素A 和他克莫司的分離效果,結(jié)果見圖2。

圖2 環(huán)孢素A 和他克莫司在不同色譜柱上的色譜圖Fig.2 Chromatograms of cyclosporine A and tacrolimus on different columns

由圖2可知,環(huán)孢素A 和他克莫司在Infinity-Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)上色譜峰展寬現(xiàn)象不明顯,色譜峰峰形尖銳、對稱。因此,試驗(yàn)選擇以Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,2.7μm)進(jìn)行色譜分離。

乙腈和甲醇是液相色譜常用的有機(jī)相,通過對比發(fā)現(xiàn),使用乙腈作為有機(jī)相時(shí),環(huán)孢素A 和他克莫司均能獲得更高的響應(yīng)值和更好的峰形,且有機(jī)相和提取溶劑一致,避免了溶劑效應(yīng)。因此,試驗(yàn)選擇采用乙腈配制有機(jī)相。流動相的酸度會影響目標(biāo)物的存在形式,進(jìn)而影響色譜分離和質(zhì)譜電離的效果,而酸可以促進(jìn)ESI＋模式下目標(biāo)物的電離,經(jīng)過系列試驗(yàn),最終選擇在水相和有機(jī)相中添加的酸為甲酸,甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1%。

2.3 特異性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法分析空白樣品和空白加標(biāo)樣品,結(jié)果見圖3。

由圖3可知,目標(biāo)物峰形良好、基線平穩(wěn)、干擾較小,方法的特異性良好。

圖3 空白樣品和空白加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the blank sample and the blank spiked sample

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別在2份10μL中濃度水平的質(zhì)控溶液中加入500μL乙腈和500μL 空白人全血樣品溶液,按照試驗(yàn)方法測定,以后者與前者峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME)值。結(jié)果顯示,環(huán)孢素A 和他克莫司的ME值分別為87.90%,110.5%,說明存在一定的ME。因此,試驗(yàn)選擇采用基質(zhì)匹配法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

按照試驗(yàn)方法分析基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以環(huán)孢素A 和他克莫司的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示,環(huán)孢素A 和他克莫司工作曲線的線性范圍分別為10～2 000 μg·L－1和0.5～100μg·L－1,線性回歸方程分別為y＝4.250×10－5x＋3.580×10－5和y＝4.960×10－3x＋7.350×10－4,相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7和0.999 6。

以空白加標(biāo)的方法進(jìn)行試驗(yàn),以不小于3,10倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)量作為環(huán)孢素A 和他克莫司的檢出限和測定下限,檢出限分別為1.24,0.05μg·L－1,測定下限分別為3.19,0.18μg·L－1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

在3份180μL空白人全血樣品中分別加入低、中、高等3個(gè)濃度水平的質(zhì)控溶液各20μL,按照試驗(yàn)方法測定,每個(gè)濃度水平每天重復(fù)測定5次,連續(xù)測定5 d,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

由表2可知,環(huán)孢素A 和他克莫司的回收率分別為92.2%～106%和94.1%～108%,日內(nèi)RSD 分別為2.9%～7.8%和4.7%～7.6%,日間RSD 分別為4.5%～6.7%和5.1%～8.2%。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.7 方法對比

分別采用本法和HPLC[7]分析空白加標(biāo)樣品(環(huán)孢素A 和他克莫司的加標(biāo)量分別為1 000,50μg·L－1)。結(jié)果顯示,兩種方法測定值相對偏差的絕對值為3.0%～6.6%,說明方法的一致性較好,但本法采用的固相萃取柱為通過式固相萃取柱,省去了活化、洗脫等步驟,操作更簡單;除此之外,HPLC中共提取物容易污染色譜及質(zhì)譜系統(tǒng),給定量分析帶來干擾,而本法基線平穩(wěn)、干擾較小,且使用基質(zhì)匹配法和內(nèi)標(biāo)法定量,測定值更加準(zhǔn)確、可靠。

2.8 質(zhì)控試驗(yàn)

為避免出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果,在實(shí)際樣品分析時(shí)必須插入質(zhì)控樣,以確保測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。以未服用相關(guān)藥物的健康人全血為空白樣品,分取2份空白樣品各180μL,在其中1份中加入中濃度水平的質(zhì)控溶液20 μL,另1 份加入甲醇20μL,按照試驗(yàn)方法制備空白加標(biāo)樣品溶液和空白樣品溶液,并在每分析20個(gè)實(shí)際樣品時(shí)依次插入一個(gè)空白樣品溶液和空白加標(biāo)樣品溶液。結(jié)果顯示,在分析20個(gè)實(shí)際樣品后,空白樣品溶液中目標(biāo)物的測定值均低于檢出限,空白加標(biāo)樣品溶液中目標(biāo)物的回收率均在90.0%～110%內(nèi)。

2.9 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析10份實(shí)際樣品,結(jié)果顯示,環(huán)孢素A 和他克莫司的檢出量分別為100.6～135.0μg·L－1和8.5～13.8μg·L－1。

本工作以通過式固相萃取柱凈化人全血樣品,以HPLC-MS/MS測定其中環(huán)孢素A 和他克莫司的含量,方法的分離效果較好、靈敏度高、準(zhǔn)確度以及精密度好,可滿足血液中痕量殘留物的分析要求,可用于人實(shí)際血液樣品的檢測。