楊姍姍，仲彩萍，王儀，3，劉紫祺，3，邵慧慧，3，孫新榮，高微微，3*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.甘肅省定西市渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 定西 748200；

3.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

隨著中藥材種植勞動力成本的增加，草害問題逐漸凸顯，而除草劑的應(yīng)用對中藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的影響研究相對缺乏。黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.為桔?？泣h參屬多年生草本植物，是常用大宗藥材之一，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功效[1]。甘肅省渭源縣是中國黨參之鄉(xiāng)，主產(chǎn)的白條黨參是市場上黨參藥材的主流產(chǎn)品[2]。根據(jù)筆者調(diào)查，為解決黨參栽培種植中的草害問題，近年來，甘肅黨參產(chǎn)區(qū)開始應(yīng)用除草劑。草甘膦（glyphosate）是一種高效、低毒、廣譜的非選擇性除草劑，一般在前茬作物收獲后施用，目前，尚無草甘膦對黨參影響的報道。本研究就甘肅渭源縣使用草甘膦對黨參生長、病害發(fā)生、內(nèi)在質(zhì)量及土壤微生物群落的影響展開調(diào)查，以期為黨參種植中除草劑的使用提供參考。

1 材料

1.1 樣品

樣品由甘肅省定西市渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心孫新榮高級農(nóng)藝師鑒定為黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的根。

1.2 儀器

ABT 220-4M型電子分析天平（上海島韓實業(yè)有限公司）；PHS-25 型pH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；DZ-9001 型振蕩器（常州梅香儀器有限公司）；1200 型高效液相色譜儀及二極管陣列檢測器（DAD）、Spectr AA 55 型原子吸收分光光度計（美國Agilent 公司）；721 型紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；Miseq-300 型基因測序儀（美國Illumina 公司）；TAS-990F 型火焰分光光度計（深圳市億鑫儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試藥

對照品黨參炔苷（批號：SL8240，純度＞98%）、D（+）-無水葡萄糖（批號：1122A0231，純度≥98%）均購于北京索萊寶科技有限公司；乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；濃硫酸、硼酸、硝酸、高氯酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（批號：P815401，上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉（批號：M32207，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 調(diào)查區(qū)概況

調(diào)查區(qū)位于甘肅省定西市渭源縣清源鎮(zhèn)馬家窯村，前茬作物為蠶豆，土壤基礎(chǔ)肥為有機質(zhì)19.26 g·kg-1、全氮1.35 g·kg-1、全鉀13.6 g·kg-1、全磷2.76 g·kg-1、全鈣43.84 g·kg-1、全鐵32.15 g·kg-1、全鎂11.94 g·kg-1，pH 為8.13。調(diào)查區(qū)內(nèi)有施用草甘膦處理組（GP）面積300 m2，空白對照組（CK）面積250 m2。GP 于2019 年8 月蠶豆收獲后在雜草葉面噴施74.70%草甘膦銨鹽（劑量為2.25 kg·hm-2），2020年4月種植黨參。

2.2 檢測樣品采集

2020 年7 月下旬黨參生長季調(diào)查黨參存苗數(shù)，2020 年10 月中下旬黨參收獲時調(diào)查黨參生長及發(fā)病情況。GP 及CK 分別測定3 個點，每個點計數(shù)1 m2的黨參的存苗數(shù)，稱量地上及地下部鮮質(zhì)量，統(tǒng)計根腐病發(fā)病率及病情指數(shù)；將黨參根60 ℃干燥箱中干燥，粉碎過60 目篩，室溫密封保存，用于測定黨參炔苷及多糖含量。同時，挖取土壤樣品，去除地表1～5 cm 的表土，挖取根5 cm 范圍內(nèi)距地表5～15 cm 處的土壤作為根際土壤，密封，4 ℃低溫保存，3 d 內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，1 個月內(nèi)測定根際土壤微生物組（北京奧維森基因科技有限公司）。

2.3 黨參根腐病分級標準及病情指數(shù)計算

黨參根腐病嚴重度分級標準參照孫新榮等[3]報道方法。0 級：不發(fā)??；1 級：地上莖葉1/2 以下萎蔫，根部外觀正常，內(nèi)部維管束1/2 以下出現(xiàn)黃色病變，或地上莖葉1/2 以下枯黃，莖葉基部和根部出現(xiàn)1～3個病斑；3 級：地上莖葉1/2 以上萎蔫，根內(nèi)部維管束1/2（含1/2）以上出現(xiàn)黃色或紅色病變，或地上莖葉1/2（含1/2）以上枯黃，莖葉基部和根部出現(xiàn)3個以上病斑并開始腐爛；5 級：地上莖葉全部青枯，根部維管束全部變?yōu)辄S色或紅色，出現(xiàn)軟腐，或地上莖葉全部枯黃，根部腐爛在1/2 以下；7 級：地上莖葉枯死，根部全部腐爛。病情指數(shù)按公式（1）計算。

2.4 黨參中成分含量測定測定

黨參炔苷的提取和測定：參照高石曼等[4]報道方法，精密稱定黨參細粉1 g，加70%甲醇30 mL，超聲提取2 次，每次30 min。色譜柱為Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），進樣量為10 μL；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，5%B；8～10 min，5%～8%B；10～25 min，8%～15%B；25～26 min，15%～20%B；26～36 min，20%B；36～48 min，20%～37%B；48～55 min，37%～60%B；55～70 min，60%B；70～80 min，60%～90%B；80～90 min，90%B）；流速0.8 mL·min-1；檢測波長為267 nm；柱溫為30 ℃。

多糖的提取和測定：參照高石曼等[4]報道方法，精密稱定黨參細粉0.25 g，加入80%乙醇150 mL，加熱回流提取1 h，濾過，殘渣加水150 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液定容至250 mL。精密量取上述液體2 mL 用水定容至10 mL，取1 mL 加入等體積5%苯酚及濃硫酸5 mL，搖勻，于紫外-可見分光光度儀490 nm下測定吸光度。

2.5 黨參根際土壤微生物測定

取土壤樣本0.4 g，使用MOBIO PowerSoil?DNA提取試劑盒提取土壤總DNA。細菌群落用通用正向引物（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和反向引物（5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增16SrRNA基因的V3-V4區(qū)；真菌群落用通用正向引物（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和反向引物（5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）1區(qū)。使用Illumina 平臺對聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物進行雙端測序并分析[5]。

2.6 數(shù)據(jù)處理

對原始數(shù)據(jù)進行篩選，去除測序和建庫過程中人為添加的引物、接頭及測序過程中產(chǎn)生的低質(zhì)量序列（quality score＜20）。采用Mothur V1.37.0軟件去除＜200 bp 的原始片段。采用USEARCH V8.1.1861 軟件參照Gold 和UNITE 數(shù)據(jù)庫移除嵌合體。采用UPARSE 軟件將序列按照97%的相似度聚類為操作分類單元（OTU）。為了減少對稀有OTU 的過度估計，從隨后的分析中去除Singletons OTUs（即樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU）。利用Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫對具有代表性的OTU序列進行比對和注釋。采用QIIME V1.8軟件分析Coverage、Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)[6]。用獨立樣本t檢驗分析比較各處理間生長指標、病害指標及群落結(jié)構(gòu)指標差異的顯著性（閾值設(shè)為0，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

3 結(jié)果與分析

3.1 草甘膦對黨參存苗及生長的影響

調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用草甘膦對生長季（7月）黨參存苗數(shù)影響較小但可顯著降低收獲季（10 月）黨參的存苗數(shù)（P＜0.05），與CK 相比，存苗數(shù)下降23.08%；在黨參收獲時，GP 黨參根生物量降低35.93%，地上部分的生物量降低5.03%，但與CK相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 草甘膦對黨參生長期1 m2的黨參存苗數(shù)及收獲期每平方米鮮質(zhì)量的影響（, n=3）

3.2 草甘膦對黨參根腐病發(fā)生的影響

采用根腐病病情指數(shù)評價黨參收獲時根腐病發(fā)生情況，結(jié)果顯示，GP 平均發(fā)病率和平均病情指數(shù)與CK 相比均顯著上升（P＜0.05），分別提高了34.51%和34.81%（圖2）。施用草甘膦加重了根腐病的發(fā)生。

圖2 草甘膦對黨參根腐病發(fā)生的影響（, n=3）

3.3 草甘膦對黨參中成分含量的影響

黨參炔苷和多糖含量測定結(jié)果顯示，GP 黨參炔苷平均質(zhì)量分數(shù)與CK相比減少9.87%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；多糖質(zhì)量分數(shù)顯著下降（P＜0.05），比CK降低42.10%（圖3）。這說明草甘膦的使用主要導(dǎo)致多糖含量下降，對黨參炔苷含量也有一定影響。

圖3 草甘膦對黨參炔苷和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響（, n=3）

3.4 草甘膦對黨參根際土壤微生物多樣性的影響

對黨參根際土壤樣品細菌16S rDNA 的V3-V4區(qū)、真菌ITS 高通量測序結(jié)果進行分析，分別得到336 234、505537條優(yōu)化序列，用聚類的方法生成20208、3331個OTU。OTU 的聚類分析覆蓋了黨參根際土壤微生物的97%以上，表明該測序結(jié)果能反應(yīng)黨參根際土壤微生物群落的變化情況。

α-多樣性的分析結(jié)果表明，對于細菌，GP 的Chao1 指數(shù)及Shannon 指數(shù)有所降低，Simpson 指數(shù)無變化；對于真菌，GP 的Chao1 指數(shù)及Simpson 指數(shù)增加，Shannon 指數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明草甘膦處理對黨參根際土壤微生物α-多樣性影響不大（表1）。

表1 黨參根際土壤微生物的α-多樣性

β-多樣性指數(shù)主坐標分析（PCoA）顯示，GP根際土壤細菌群落與CK 重合（R=0.950 6，P＞0.05，圖4A），根際真菌群落與CK 相鄰（R=0.074 1，P＞0.05，圖4B），草甘膦對黨參根際土壤微生物群落組成無顯著影響。

圖4 黨參根際土壤細菌和真菌微生物OTU水平PCoA

3.5 草甘膦對黨參根際土壤細菌群落組成和豐度的影響

對黨參根際土壤樣品中細菌群落組成進行分析，共檢測到41個門。其中，變形菌門（Protebacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的相對豐度均大于1%，是黨參根際土壤中的優(yōu)勢菌門，其他35個門的豐度占比均小于1%（圖5A）。與CK相比，Chloroflexi的相對豐度降低了19.97%、Bacteroidota的相對豐度增加27.37%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

對所有相對豐度＞5%的5個細菌優(yōu)勢菌目進行分析，結(jié)果顯示，草甘膦處理組中Vicinamibacterales、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）的相對豐度分別比CK增加了5.56%、20.15%和47.96%，而根瘤菌目（Rhizobiales）和芽單胞菌目（Gemmatimonadales）的相對豐富度分別下降了10.31%和5.93%，其中Burkholderiales和Sphingomonadales 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5B）。

圖5 黨參根際土壤細菌群落在門和部分目水平上的相對豐度（, n=3）

3.6 草甘膦對黨參根際土壤真菌群落組成和豐度的影響

從綱水平對黨參根際土壤樣品中真菌群落組成進行分析，共檢測到40 個綱，其中，盤菌綱（Pezizomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothidemmycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）和銀耳綱（Tremellomycetes）5個綱的相對豐度均大于1%，是黨參根際土壤中的優(yōu)勢菌綱，其余35個綱的相對豐度占比均小于1%（圖6A）。與CK相比，GP 中Mortierellomycetes、Dothidemmycetes 和Tremellomycetes的相對豐度增加了23.36%、3.10%和8.79%，Sordariomycetes和Pezizomycetes 的相對豐度降低了17.23%和42.09%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從屬水平對黨參根際土壤樣品中相對豐度＞5%的4個真菌優(yōu)勢菌目進行分析，結(jié)果顯示，GP中被孢霉屬（Mortierella）、Titaea和赤霉屬（Gibberella）的相對豐度分別增加了23.36%、4.26%和17.78%，毛殼菌屬（Chaetomium）的相對豐度下降了32.01%，但與CK相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖6B）。

圖6 黨參根際土壤真菌群落在綱和部分屬水平上的相對豐度（, n=3）

4 討論

草甘膦是世界上使用最廣泛的除草劑之一，具有高效、低毒、廣譜等特點，易與土壤有機物或礦物質(zhì)結(jié)合而失去活性，被認為是一種相對安全的除草劑[7]。然而，筆者在甘肅黨參產(chǎn)區(qū)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，當?shù)厥┯貌莞熟? 個月后種植黨參，仍然出現(xiàn)生長勢減弱的現(xiàn)象。本研究結(jié)果證實，草甘膦可顯著降低收獲季黨參的存苗數(shù)、加重根腐病的發(fā)生，并降低黨參炔苷和多糖的含量。由于草甘膦在土壤中的半衰期一般只有3～40 d[8]，從2019 年8 月前茬作物蠶豆收獲后使用到2020 年4 月種植黨參間隔8 個月，理論上草甘膦已完全降解，草甘膦對黨參不存在直接抑制作用，7 月田間存苗數(shù)的調(diào)查結(jié)果支持了上述推測。有研究報道，草甘膦可導(dǎo)致玉米和大豆根際土壤中Proteobacteria 相對豐度增加、Acidobacteria 相對豐度降低[9]。因此，筆者認為草甘膦對黨參的影響可能來源于間接的土壤微生物的改變。

土壤微生物多樣性是評價土壤微生物群落特征和穩(wěn)定性的重要指標，土壤微生物組成與植物的生長與健康密切相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然GP 與CK相比根際土壤細菌及真菌多樣性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但可顯著增加根際土壤細菌中Burkholderiales和Sphingomonadales 的相對豐度。以往研究表明，Burkholderiales 包含多種植物病原，如伯克霍爾德菌Burkholderia plantarii是引起水稻秧苗細菌性立枯病的重要病原菌之一，其侵染性、繁殖力及適應(yīng)性均很強，嚴重威脅中國水稻生產(chǎn)[11-13]；Sphingomonadales 可作用于有機磷化合物的生物降解，具有很好的農(nóng)藥降解能力[14]，其相對豐度增加可能與草甘膦的降解相關(guān)。本研究基于所有微生物OTUs 計算的多樣性指數(shù)，在CK 與GP 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但部分細菌豐度發(fā)生顯著改變，導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化。

施用草甘膦導(dǎo)致的根腐病加重，與土壤微生物雖然有一定關(guān)系，但很可能只是原因之一，其他作用因子還有待進一步研究探討。本次調(diào)查樣地的草甘膦用量為通用的劑量，鑒于草甘膦對黨參的綜合影響，黨參種植地應(yīng)盡量避免除草劑草甘膦的施用。