湯春花，梁鳳友，高永堅，曾杉，李秀嫻，陳雨平，李靜榮

國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

多數(shù)45～55歲的女性體內雌激素和孕激素逐漸減少，月經(jīng)周期的頻率發(fā)生改變，最初被稱為更年期前期，月經(jīng)停止12 個月時，被稱為更年期，也稱圍絕經(jīng)期（perimenopausal）。這一階段除了月經(jīng)周期的改變外，還會出現(xiàn)如潮熱、盜汗、失眠、情緒低落、泌尿生殖系統(tǒng)不適等癥狀，這一系列的表現(xiàn)也稱為圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome，PMS）[1-2]。目前臨床上對于PMS 多采用雌激素替代療法，但這一療法不良反應較大、療效不理想[3-4]，許多人無法耐受。因此，亟須進一步探討PMS 的發(fā)病機制，為PMS的治療提供新的安全、有效、耐受的治療藥物。

中醫(yī)理論中，雌激素和其他激素統(tǒng)稱為精，精藏在中醫(yī)的“腎”實體中，是所有陰陽的起源。PMS 是由于精的減少，導致陰陽之間的平衡紊亂等多種癥狀，潮熱盜汗即是陰無法抑制陽的活動的信號?！饵S帝內經(jīng)》中描述圍絕經(jīng)期：“女子七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！保?］“天癸”是腎精腎氣充盛到一定程度時，體內出現(xiàn)的具有促進生長、發(fā)育、生殖的一種物質，故PMS 的發(fā)生主要以腎虛為主。栗春芳等[6]認為腎為五臟陰陽之本，腎虛導致臟腑功能失調，出現(xiàn)各種臨床癥狀。綜上，腎陰虛是PMS 發(fā)生的根本原因，腎陰不足，不能上濟心火，則心火偏亢，至虛火伏藏陰分，寐則衛(wèi)氣行于陰，助長陰分伏火，兩陽相加，迫使陰液汗出而盜汗。

當歸六黃湯源于金代名醫(yī)李杲的《蘭室秘藏》，由當歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃柏、黃連、黃芪7 味藥組成，功能主治為滋陰瀉火、固表止汗[7]，《蘭室密藏》卷下稱當歸六黃湯為“治盜汗之圣藥也”［8］?，F(xiàn)代研究表明，當歸六黃湯治療陰虛火旺型圍絕經(jīng)期綜合征療效確切，治療后患者雌二醇水平顯著高于化學藥組，黃體生成素、卵泡刺激素顯著低于化學藥組，且不良反應發(fā)生率低，用藥安全性更高[9]。但當歸六黃湯治療PMS 的作用機制尚不明確。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學，通過多組分、多靶點、多通路的篩選，網(wǎng)絡可視化和網(wǎng)絡拓撲學分析，闡明藥物、靶點和疾病之間復雜的網(wǎng)絡關系，預測和分析中藥的多靶點作用機制，為當歸六黃湯治療PMS提供參考。

1 材料與方法

1.1 當歸六黃湯活性成分和靶點篩選

分別以當歸、黃芪、熟地黃、生地黃、黃芩、黃連、黃柏為關鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索當歸六黃湯的全部活性成分，建立當歸六黃湯化學成分數(shù)據(jù)庫。采用口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）2 項指標評價當歸六黃湯活性成分的成藥性。設置OB≥30%、DL≥0.18 篩選活性成分，并獲取活性成分對應蛋白靶點。將蛋白靶點數(shù)據(jù)輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），選擇物種為人，進行歸一化和標準化命名，刪除沒有對應基因名稱的目標蛋白，獲得活性成分對應的靶點基因。通過文獻報道[10]完善生地黃的活性成分和靶點信息。

1.2 PMS 靶點篩選及其與活性化合物交集靶點的分析

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫獲取與PMS相關的靶點，將1.1 項下獲取的活性成分靶點和PMS 疾病靶點導入微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖網(wǎng)站，繪制韋恩圖，得到活性成分-PMS的交集靶點。

1.3 藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡構建

將1.2項下獲取的活性成分和對應的交集靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.1軟件，建立藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡圖，并采用軟件中的“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡拓撲分析，篩選出核心活性成分和潛在靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建及拓撲分析。

將1.2項下獲取的交集靶點導入STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple proteins”，種屬設置為“Homo sapiens”，Interaction score 設定為0.400，并選擇隱藏散在的節(jié)點，獲取交集靶點的PPI網(wǎng)絡。將PPI網(wǎng)絡的結果導入Cytoscape 3.7.1軟件中進行可視化分析，通過CytoNCA 插件進行拓撲學分析，分別以度值（degree，表示某一節(jié)點與其他節(jié)點的連接性）、中間中心性（betweenness centrality，BC，表示經(jīng)過某一節(jié)點的最短路徑的數(shù)量）、接近中心性（closeness centrality，CC，表示某一節(jié)點與網(wǎng)絡中其他節(jié)點的平均距離）的中位值為條件，篩選確定核心靶點。

1.5 交集靶點的基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將1.2 項下獲得的交集靶點導入metascape 在線數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/），進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。其中，GO 富集分析通過3個維度來解釋和注釋基因，包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過程（BP）分析；而KEGG通路富集主要進行路徑分析。分析物種為“Human（智人）”，每條通路至少包含3 個基因，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 藥物成分-核心靶點分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016軟件對當歸六黃湯關鍵活性成分與核心靶點的結合能力進行對接預測。當歸六黃湯關鍵活性成分的.Mol2 格式文件和蛋白質的.PDB 格式文件分別從TCMSP 和PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載。導入后，將目標蛋白的所有晶體水分子清除，采用軟件中的“prepare protein”模塊對蛋白質受體進行去除原配體、水分子及添加氫原子等預處理并尋找活性口袋。對小分子配體進行能量最小化處理，并將小分子配體的所有柔性鍵設置為可旋轉，應用軟件中的CDOCKER功能對核心靶點蛋白受體和活性成分小分子配體進行分子對接。以目標蛋白與配體之間的氫鍵、靜電相互作用、π-π 鍵或范德華力等各種鍵能來計算兩者的結合能。結合能表示為負數(shù)，數(shù)值越高表示結合能力越強，結合越穩(wěn)定。受體蛋白和小分子之間相互作用以2D結構表示。

2 結果

2.1 當歸六黃湯活性成分和靶點篩選結果

通過TCMSP共檢索到當歸六黃湯主要活性化合物111 個，其中當歸2 個、黃芪20 個、熟地黃2 個、黃芩36 個、黃連14 個、黃柏37 個。進一步得到活性成分對應的蛋白靶點，刪除無對應蛋白靶點的活性成分。將蛋白靶點數(shù)據(jù)輸入UniProt數(shù)據(jù)庫進行比對和矯正，刪除無對應靶點基因的靶蛋白，輸出對應的靶點基因。與此同時，通過查閱文獻[10]完善了生地黃的活性成分1個和靶點基因38個，共獲得活性成分86個和對應靶點基因216個?；钚猿煞忠姳?。

表1 當歸六黃湯主要活性成分

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 PMS靶點及其與活性化合物交集靶點分析

獲取PMS 相關的843 個靶點基因，將其與當歸六黃湯活性化合物的216 個靶點基因一并導入微生信在線作圖網(wǎng)站，繪制韋恩圖，取交集得到活性成分與疾病交集靶點基因共52個（圖1），這些基因被認為是當歸六黃湯治療PMS的潛在作用靶點。

圖1 當歸六黃湯藥物靶點和PMS疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡構建

將活性成分和對應的交集靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件建立藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡有126個節(jié)點、545條邊（圖2）。并采用軟件中的NetworkAnalyzer 功能進行網(wǎng)絡拓撲分析，篩選出5個關鍵活性成分，見表2。

表2 當歸六黃湯治療PMS度值和BC值均在前10的關鍵活性成分

圖2 當歸六黃湯治療PMS的藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及拓撲分析

將上述52 個交集靶點導入STRING 網(wǎng)站構建PPI網(wǎng)絡，隱藏游離節(jié)點。將獲得的PPI網(wǎng)絡的.TSV格式文件導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行可視化分析，得到含51 個節(jié)點、670 條邊的網(wǎng)絡（圖3A）。利用NetworkAnalyzer 對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析和計算后，進行第一輪篩選，取度值≥12、BC≥0.009、CC≥0.510 的靶點，得到含有20 個節(jié)點、232 條邊的網(wǎng)絡（圖3B）。第二輪篩選取度值≥20、BC≥0.024、CC≥0.575 的靶點，得到含有5 個節(jié)點、20 條邊的網(wǎng)絡（圖3C）。經(jīng)過2 輪篩選最終得到5 個核心靶點，分別為白細胞介素-6（IL-6）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、IL-1B 和糖皮質激素受體基因亞科3 C組成員1（NR3C1），見表3。

表3 當歸六黃湯治療PMS核心靶點

圖3 當歸六黃湯治療PMS交集靶點PPI網(wǎng)絡

2.5 交集靶點的GO功能注釋和KEGG富集分析

對52個交集靶點的GO功能注釋分析共得到800個條目（P＜0.05），包括BP 678 個、CC 37 個、MF 85 個。其中BP 主要涉及對異種刺激的反應、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、對類固醇激素的反應、管徑調節(jié)、異生物分解代謝過程、對脂多糖的反應等；CC 主要涉及膜筏、突觸前膜的組成部分、轉錄調節(jié)復合物、受體復合物、細胞器外膜等；MF主要集中于α-腎上腺素能受體活性、核受體活性、雌激素2-羥化酶活性、細胞因子受體結合等，見圖4A。

KEGG 富集分析主要集中在化學致癌-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、突觸小泡循環(huán)、AMPK 信號通路等。KEGG 信號通路氣泡圖如圖4B所示。結果提示，發(fā)揮抗炎和雌激素樣協(xié)同作用，減少癌癥和心血管并發(fā)癥，可能是當歸六黃湯治療PMS的主要機制。

圖4 當歸六黃湯治療PMS靶點的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

2.6 藥物成分-核心靶點分子對接驗證結果

將2.3項下所得關鍵活性成分和2.4項下所得的5 個核心靶點基因進行分子對接驗證，并通過Discovery Studio 2016 計算配體與受體的結合能。結果顯示當歸六黃湯關鍵活性成分能夠與不同核心靶點活性口袋中1 個或多個氨基酸殘基結合，形成氫鍵、π-π 鍵或范德華力等，從而形成穩(wěn)定的對接模式，各化合物與核心靶基因結合能見表4。選擇結合能最低的構象（-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY 得分最好）對接結果進行2D 可視化展示（圖5）。

圖5 當歸六黃湯治療PMS活性化合物與核心靶點結合能最低的構象

表4 當歸六黃湯治療PMS活性化合物與核心靶基因結合能 kcal·mol-1

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學與分子對接相結合的方法，研究當歸六黃湯治療PMS 的潛在活性成分、靶點和作用機制。通過對當歸、黃芪、熟地黃、生地黃、黃芩、黃連、黃柏化學成分分析，確定了當歸六黃湯中關鍵活性成分可能為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇。分子對接結果證明，這些化合物可以與大多數(shù)核心靶形成穩(wěn)定的對接模式。槲皮素和山柰酚是黃酮醇類植物雌激素，其結構與雌二醇結構類似，可以結合雌激素受體并經(jīng)其介導發(fā)揮作用，是很好的雌激素替代藥物[11-12]。槲皮素和山柰酚還具有抗癌、抗炎、保護血管和神經(jīng)元等生物活性[13-15]。豆甾醇和β-谷甾醇是常見的植物甾醇，被用于治療各種炎癥性疾病[16]，研究表明，豆甾醇對毒性誘導的神經(jīng)元細胞具有很好的保護作用[17]。此外，β-谷甾醇還具有抗糖尿病、調血脂、抗癌等作用[18]。

對當歸六黃湯和PMS的52個交集靶點基因進行PPI分析，篩選確定了當歸六黃湯治療PMS的5個核心靶基因，即IL-6、PTGS2、ESR1、IL-1B和NR3C1。研究表明，雌激素缺乏會引起女性外陰、陰道和膀胱尿道區(qū)域出現(xiàn)萎縮癥狀，50%以上的圍絕經(jīng)期女性受之困擾，臨床上主要表現(xiàn)為生殖器刺激、干燥和灼熱等炎性癥狀[19]。IL-6和IL-1B 是細胞因子，可介導炎性反應參與免疫細胞的形成［20-21］。PTGS2 是一種誘導型酶，在大多數(shù)細胞中不表達或少量表達，當細胞受到促炎細胞因子和癌癥促進劑的刺激時，PTGS2 的表達上調并參與炎癥和腫瘤的形成和發(fā)展[22]。ESR1基因編碼雌激素受體α（ERα），可以結合槲皮素、山柰酚等植物雌激素發(fā)揮雌激素樣作用[11]。據(jù)研究，NR3C1基因的甲基化水平與認知障礙有關[23]。

KEGG 富集分析主要集中在化學致癌-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、突觸小泡循環(huán)、AMPK 信號通路等。臨床研究顯示，圍絕經(jīng)期女性是生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的高發(fā)期[24]，當歸六黃湯可能通過“化學致癌-受體激活”和“癌癥”信號通路發(fā)揮抑制腫瘤的作用。心血管疾病是PMS 的遠期并發(fā)癥之一，隨著女性趨于絕經(jīng)年齡，雌激素缺乏導致機體組織中的內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性下調、NO合成受阻進而影響血管正常功能，這是促使冠心病、高血壓等一系列心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素[19]。當歸六黃湯可能通過脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化和AMPK 信號通路來防治PMS 患者的心血管疾病。PMS 患者絕大部分會伴有盜汗和精神神經(jīng)癥狀。雌激素水平低下會導致植物神經(jīng)功能紊亂和代謝障礙，從而引發(fā)盜汗癥狀[25]。同時低水平的雌激素還會致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內單胺氧化酶的活性失于抑制，進而促進了中樞神經(jīng)遞質的降解，5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質的合成受限，導致情緒障礙類癥狀的發(fā)生[26-27]。當歸六黃湯可能通過雌激素信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸、突觸小泡循環(huán)信號通路發(fā)揮雌激素樣作用，從而調控PMS 患者的盜汗和精神神經(jīng)癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，激活AMPK 信號通路可有效抑制IL-1B、IL-6 等促炎因子的分泌[28]，推測當歸六黃湯可通過激活AMPK信號通路發(fā)揮抗炎作用。

4 結論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接分析了當歸六黃湯治療PMS 潛在活性成分、靶點和作用途徑。共獲取112 個有效活性成分，經(jīng)篩選得到5 個關鍵活性成分，分別為槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚和7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，主要發(fā)揮抗炎和雌激素樣作用；獲取52 個交集靶點，并篩選得到5 個核心靶點，分別是IL-6、PTGS2、ESR1、IL-1B 和NR3C1，主要參與炎癥反應和激素調節(jié)。KEGG 富集分析結果顯示，當歸六黃湯治療PMS主要通過化學致癌-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、突觸小泡循環(huán)、AMPK 信號通路等發(fā)揮作用。同時，通過分子對接驗證了當歸六黃湯的關鍵活性成分可以與核心靶點蛋白形成穩(wěn)定的對接模型。綜上可知，當歸六黃湯通過多成分、多靶點、多途徑的作用機制治療PMS，主要發(fā)揮抗炎和雌激素樣協(xié)同作用。