王瑩，劉芫汐，范晶，昝珂，楊建波，金紅宇，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

何首烏Polygonum multiflorumThunb.為蓼科多年生草本植物，塊根是其主要的藥用部位，具有抗衰老、調(diào)血脂、抗癌、抗炎、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)等作用[1]。近年來，多次出現(xiàn)何首烏及其制品致肝損傷的報(bào)道，引起社會(huì)廣泛關(guān)注[2-4]。為進(jìn)一步了解何首烏藥用安全情況，對(duì)市場(chǎng)收集的多批次何首烏藥材及飲片進(jìn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定。何首烏為多年生根類藥材，分布于河南、貴州、云南、四川、廣東等地，多為栽培品[5]。長(zhǎng)期的種植栽培可能產(chǎn)生一定量的有機(jī)氯殘留。前期，已有學(xué)者建立了何首烏中有機(jī)氯類農(nóng)藥測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)[6-7]；同時(shí)，有報(bào)道建立了何首烏中26 種有機(jī)磷的氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器（GC-FPD）測(cè)定法[8]。但隨著農(nóng)藥品種使用的不斷擴(kuò)大，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）自2015 年版開始收錄氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS/MS）及液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對(duì)農(nóng)藥多殘留進(jìn)行測(cè)定。目前，何首烏中關(guān)于農(nóng)藥多殘留的測(cè)定方法及篩查數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道。本課題組通過調(diào)研并結(jié)合國(guó)家禁用農(nóng)藥名錄等，篩選出100 種農(nóng)藥（113 種農(nóng)藥單體）作為檢測(cè)指標(biāo)，采用GC-MS/MS 對(duì)收集到的53 批何首烏進(jìn)行測(cè)定。

1 材料

1.1 樣品

從市場(chǎng)及種植基地共收集何首烏樣品53 批。其中，20 批收集于飲片市場(chǎng)，33 批收集于種植基地，有確定產(chǎn)地來源。53 批樣品中包括10 批制品（Z1～Z10）和43 批生品（S1～S43），見表1。樣品經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所楊建波副研究員鑒定均為正品。

表1 何首烏樣品信息

1.2 儀器

QP2040 型氣相色譜-質(zhì)譜儀（日本島津公司）；FA1004C FA/JA-C 型電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；Z260A 型離心機(jī)（德國(guó)Hermble 公司）；Hel-VAP Advantage ML/HB 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph 公司）；AH30 型高速全自動(dòng)勻漿儀（?？苾x器有限公司）；HLB 固相萃取柱（安捷倫公司500 mg/6 mL）。

1.3 試藥

D-山梨醇（純度：99.5%，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：0001423711）；D-核糖酸內(nèi)酯（純度：95.0%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S26834）；乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；氯化鈉（批號(hào)：20191206，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。農(nóng)藥對(duì)照物質(zhì)來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院、中國(guó)計(jì)量科學(xué)院、德國(guó)Ehrenstorfer公司等。自行配制質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1（溶劑為乙腈）的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃密封避光保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

DM17ms 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；流速為1.3 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；高壓不分流進(jìn)樣；升溫程序（初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min）。電子轟擊電離（EI）測(cè)定條件：70 eV，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃。GC-MS/MS 質(zhì)譜測(cè)定條件見表2。

表2 何首烏中113種農(nóng)藥化合物的tR、定量離子、定性離子、r、方法定量限（LOQ）及回收率

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 根據(jù)對(duì)照品質(zhì)譜上的響應(yīng)豐度值確定混合對(duì)照品溶液中該指標(biāo)的質(zhì)量濃度，乙腈定容，貯藏在-20 ℃冰箱中備用。100 種農(nóng)藥中包括19 種禁用農(nóng)藥，其中禁用農(nóng)藥在混合對(duì)照品溶液中質(zhì)量濃度為100～1000 ng·mL-1，其余農(nóng)藥在混合對(duì)照品溶液中質(zhì)量濃度為500～1000 ng·mL-1。

2.2.2 分析保護(hù)劑的配制 取核糖酸內(nèi)酯0.5 g，加乙腈25 mL 使溶解（A 液，20 mg·mL-1）；另取山梨醇0.25 g，加水12.5 mL溶解，加乙腈至25 mL（B液，10 mg·mL-1）。A、B溶液合并，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取供試品粉末5 g，置100 mL 試管中，加氯化鈉1 g，精密加入乙腈50 mL，12 000 r·min-1勻漿處理3 min，3500 r·min-1離心10 min（離心半徑為93 mm），分取上清液，沉淀加乙腈40 mL，勻漿2 min，3500 r·min-1離心10 min（離心半徑為93 mm），合并2次提取的上清液，50 ℃減壓濃縮至3～5 mL，用乙腈轉(zhuǎn)移并定容至25 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 空白基質(zhì)溶液的制備 取空白樣品粉末約5 g，精密稱定，置100 mL 試管中，按2.2.3 項(xiàng)下方法制備空白基質(zhì)溶液。

2.2.5 基質(zhì)混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取混合對(duì)照品溶液適量，加空白基質(zhì)溶液制成含各對(duì)照品為不同濃度系列的基質(zhì)匹配混合對(duì)照品溶液（以甲基對(duì)硫磷記，質(zhì)量濃度梯度為2、4、10、30、40 μg·L-1）。

2.3 樣品測(cè)定

分別精密量取各質(zhì)量濃度基質(zhì)混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各1.0 mL，精密加入分析保護(hù)劑溶液0.3 mL，混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾。精密吸取上述溶液各1 μL 注入GC-MS/MS 測(cè)定。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中100 種農(nóng)藥殘留量，基質(zhì)匹配混合對(duì)照品的GC-MS/MS測(cè)定總離子流圖見圖1。

圖1 GC-MS/MS測(cè)定何首烏空白基質(zhì)匹配的100種農(nóng)藥總離子流圖

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 取不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合對(duì)照品溶液，注入儀器，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各農(nóng)藥對(duì)照品線性r均大于0.991。表明線性關(guān)系良好。取混合對(duì)照品溶液，梯度稀釋后按2.3 項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，以相關(guān)定量離子信噪比（S/N）為10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為儀器定量限，根據(jù)供試品溶液質(zhì)量濃度計(jì)算方法定量限，結(jié)果見表2。

2.4.2 回收率和重現(xiàn)性試驗(yàn) 取何首烏空白樣品粉末5 g，加入適量的混合對(duì)照品溶液，按2.2、2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定。如表2 所示，平均加樣回收率為70.4%～107.4%（以甲基對(duì)硫磷為例，添加水平為0.02 mg·kg-1），RSD均小于11.40%，符合農(nóng)藥殘留測(cè)定要求。

2.5 測(cè)定結(jié)果

對(duì)53 批何首烏中的100 種農(nóng)藥進(jìn)行了篩查，上述100種農(nóng)藥均未檢出。

3 討論

3.1 農(nóng)藥參數(shù)的選擇

自《中國(guó)藥典》2020 年版執(zhí)行以來，在“0212藥材和飲片檢定通則”中增加了植物源性藥材及飲片中33 種禁用農(nóng)藥的限度規(guī)定[9]，在“2341 農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中主要采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。本研究在進(jìn)行參數(shù)選擇時(shí)，首先選擇了大部分可用GC-MS/MS 測(cè)定的禁用農(nóng)藥，對(duì)何首烏中是否存在高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥進(jìn)行篩查；其次，通過查閱文獻(xiàn)擬定了中藥中常用的農(nóng)藥，尤其是針對(duì)何首烏栽培過程中可能存在的農(nóng)藥殘留（如檢測(cè)參數(shù)中包括20 余種有機(jī)氯類農(nóng)藥，主要是因?yàn)楹问诪醵嘣?～4 年后收獲塊根，若土壤中存在不易降解的有機(jī)氯類農(nóng)藥，可能會(huì)對(duì)藥材造成污染）。前期已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在人參[10]、三七[11]中多存在六六六、滴滴涕等農(nóng)藥，而在20世紀(jì)90年代，此類農(nóng)藥在我國(guó)已明令禁止使用，藥材中檢出主要源于土壤污染。在何首烏中農(nóng)藥殘留研究的初期報(bào)道中，亦在多批次何首烏中檢出六六六、滴滴涕及五氯硝基苯等農(nóng)藥[6-7]。此外，通過查閱相關(guān)書籍，總結(jié)出何首烏病蟲害主要包括葉斑病、輪紋病、異色柱螢葉甲、茶黃薊馬等，防治病害時(shí)多用甲基托布津、多菌靈、百菌清及代森錳鋅等噴射植株；防治蟲害多用氯氰菊酯、溴氰菊酯、吡蟲啉等農(nóng)藥[12-13]。在本方法檢測(cè)參數(shù)中亦包括了百菌清、氯氰菊酯、溴氰菊酯等GC-MS/MS可測(cè)定的參數(shù)。

3.2 前處理的選擇

對(duì)何首烏生品及制品的前處理?xiàng)l進(jìn)行了考察和優(yōu)化，包括乙腈高速勻漿直接提取及提取后采用HLB 柱進(jìn)行凈化。從回收率結(jié)果來看，3 種凈化方法回收率均為60%～120%，符合實(shí)驗(yàn)要求。何首烏為塊根，基質(zhì)較為簡(jiǎn)單，本研究采用直接提取法基本可滿足分析要求。此法操作簡(jiǎn)便、成本低、提高了農(nóng)藥分析的效率。但值得注意的是，采用此法進(jìn)行多批次樣品檢測(cè)時(shí)，儀器端流入成分增加，可能會(huì)對(duì)儀器造成一定污染，故在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意儀器的維護(hù)保養(yǎng)。建議根據(jù)觀察基質(zhì)標(biāo)液的響應(yīng)值變化推測(cè)進(jìn)樣口端及儀器的狀態(tài)，從而進(jìn)行有效維護(hù)。

3.3 分析保護(hù)劑的使用

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect）廣泛存在于農(nóng)藥殘留測(cè)定中，是指樣品中目標(biāo)分析物以外的組分對(duì)目標(biāo)分析物分析過程的離子化產(chǎn)生的抑制與增強(qiáng)作用[14]，極大地影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用GC-MS/MS進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)會(huì)增強(qiáng)。目前，改善基質(zhì)效應(yīng)的主要方法有空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品凈化、同位素內(nèi)標(biāo)、分析保護(hù)劑、標(biāo)準(zhǔn)加入法等[15]?！吨袊?guó)藥典》2020年版“2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中主要采用空白基質(zhì)匹配法校正基質(zhì)效應(yīng)[9]，本研究亦采用此方法對(duì)農(nóng)藥殘留量進(jìn)行定量分析。但在進(jìn)行基質(zhì)匹配時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分農(nóng)藥色譜峰仍存在峰拖尾、響應(yīng)值不高的問題，故本方法測(cè)定時(shí)在樣品和對(duì)照品中同時(shí)加入了分析保護(hù)劑以改善峰形、提高農(nóng)藥的靈敏度。

分析保護(hù)劑為Erney等[16]于1993年首次提出，是一種模仿基質(zhì)保護(hù)作用的單一化合物或簡(jiǎn)單混合物。其原理是在溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中加入保護(hù)劑后，可以同等程度地補(bǔ)償兩者的基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)而提高定量的準(zhǔn)確性。本課題組于2010 年通過對(duì)多種潛力化合物的考察，最終選擇以核糖酸內(nèi)酯和山梨醇組合作為農(nóng)藥GC-MS-MS 測(cè)定的分析保護(hù)劑，并首次將其應(yīng)用于中藥農(nóng)藥殘留測(cè)定中[17]。近年來，此分析保護(hù)劑組合也在其他品種中藥的農(nóng)藥殘留測(cè)定中得到廣泛應(yīng)用，驗(yàn)證了其有效性。例如，在陳皮[18]、白茅根[19]、當(dāng)歸[20]、麥冬[21]中的農(nóng)藥多殘留GCMS/MS測(cè)定中，均采用分析保護(hù)劑以提高定量準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果亦證明，在加入分析保護(hù)劑后，特丁硫磷、水胺硫磷、甲草胺和丁草胺等峰形得到明顯改善。

4 小結(jié)

本研究建立的方法適用于何首烏（生品和制品）中100 種農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS 檢測(cè)，對(duì)何首烏中農(nóng)藥監(jiān)測(cè)有一定參考價(jià)值。同時(shí)，采用此方法完成了53 批何首烏中農(nóng)藥殘留篩查，樣品代表性較好，反映了不同產(chǎn)地、生制品何首烏中農(nóng)藥污染真實(shí)情況。通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，53 批樣品中均未檢出此100 種農(nóng)藥，初步表明何首烏中農(nóng)藥殘留帶來的藥用風(fēng)險(xiǎn)性較小，對(duì)進(jìn)一步了解何首烏藥用安全提供了充分?jǐn)?shù)據(jù)。