王雪婷，楊建波，程顯隆，汪祺，高慧宇，宋云飛，王瑩，魏鋒，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

何首烏為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版收載品種，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThumb.的干燥塊根，于秋、冬兩季葉枯萎時(shí)采挖，削去兩端，洗凈，個(gè)大的切成塊，干燥，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效[1]。制首烏為何首烏的炮制加工品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁調(diào)脂的作用，臨床可用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、高脂血癥[1]。何首烏中主要的活性成分為2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蒽醌（結(jié)合蒽醌和游離蒽醌）、黃酮、萘、酰胺等類成分，但是這些不同類型化合物極性差別較大[2-5]?！吨袊?guó)藥典》2020 年版何首烏和制首烏項(xiàng)下【鑒別】項(xiàng)中的供試品溶液制備方式采用加熱回流提取，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力；薄層鑒別方法采用三氯甲烷-甲醇為展開(kāi)劑，毒性較大，展開(kāi)后主斑點(diǎn)數(shù)較少，分離度相對(duì)較差，且需要二次展開(kāi)，操作較為繁瑣。為此，通過(guò)前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道[6-12]，本研究對(duì)何首烏和制何首烏的提取方式及薄層色譜鑒別方法進(jìn)行改進(jìn)，以超聲提取代替加熱回流制備樣品，采用毒性較低的二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)代替三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，同時(shí)增加石油醚-乙酸乙酯-甲酸系統(tǒng)對(duì)極性較低的成分斑點(diǎn)進(jìn)行鑒別，結(jié)果得到了優(yōu)于《中國(guó)藥典》2020年版何首烏【鑒別】項(xiàng)下方法的斑點(diǎn)和顯色效果，有助于何首烏和制何首烏藥品標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高和優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

QUINTIX313-1CN 型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz）；AST 4 型半自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀、ADC 2型全自動(dòng)薄層色譜展開(kāi)儀、Visualizer 型薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；硅膠G60薄層板（德國(guó)Merck公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：110844-201915，純度：90.7%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，純度：96.0%）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817，純度：99.2%）、何首烏對(duì)照藥材（批號(hào)：120934-201410）和制何首烏對(duì)照藥材（批號(hào)：121454-201806）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：23313-21-5，純度：98%）、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：23451-01-6，純度：98%）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；常規(guī)試劑為分析純。

22 批生何首烏樣品和34 批制何首烏樣品均經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院楊建波副研究員鑒定為何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根及其炮制品，樣品信息見(jiàn)表1～2。

表1 何首烏樣品信息

制何首烏樣品Z1～Z18、Z34 為實(shí)驗(yàn)室自制：Z1～Z18 采用《中國(guó)藥典》2020 年版通則（0213）[13]蒸法炮制加工，取何首烏片（批號(hào)：S8、S22）約1 kg，分別加入超純水、黑豆汁670 mL，拌勻，靜置過(guò)夜使汁吸盡，置木質(zhì)蒸屜隔水加熱，在2、4、8、12、18、24、30、36、48 h 分別取出一定量樣品，曬干，分別得到清蒸（Z1～Z9）、拌入黑豆汁蒸（Z10～Z18）制何首烏樣品。黑豆汁制法：取黑豆1 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約1.5 kg，豆渣再加水煮約3 h，熬汁約1 kg，合并得黑豆汁約2.5 kg。Z34為燉制何首烏，參照《中國(guó)藥典》2020 年版通則（0213）燉法炮制，取何首烏（批號(hào)：S8）約1 kg，用黑豆汁拌勻，置非鐵質(zhì)的適宜容器內(nèi)，燉至汁液吸盡，得到制何首烏樣品[5]。

表2 制何首烏樣品信息

Z19～Z20 參照《中國(guó)藥典》 2020 年版通則（0213）方法，拌入黑豆汁燉制。

Z21～Z22 樣品制法：輔料為黑豆汁（10%黑豆，首次煮4 h，再次煮3 h，合并2 次黑豆汁即得）；黑豆汁與何首烏塊拌勻，潤(rùn)12 h；蒸箱蒸8 h，燜過(guò)夜（約14 h）；干燥7.5 h（敞開(kāi)式烘箱，70 ℃）；蒸4 h（沒(méi)有燜），曬干。

Z23～Z24 樣品制法：將凈何首烏200 kg 放到不銹鋼盤(pán)，取黑豆20 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約20 kg，合并得黑豆汁約45 kg，然后倒入黑豆汁和何首烏攪拌均勻，燜潤(rùn)12 h 即可。將完全潤(rùn)透的何首烏放入蒸藥機(jī)，蒸制時(shí)間10 h，溫度100 ℃，蒸制5 h后取樣觀察色澤情況（由紅褐色部分變成黑褐色或棕褐色，取樣檢測(cè)指標(biāo)成分含量變化），待蒸制10 h后，表面由紅褐色全部變成黑褐色或棕褐色，取樣檢測(cè)指標(biāo)成分含量變化。

Z25～Z26 樣品制法：照《中國(guó)藥典》2020 年版通則（0213）[13]蒸法，黑豆3 kg，加水80 L 煎煮8 h（煎煮2次，第1次煎煮后浸泡過(guò)夜）。煎煮液加何首烏18 kg，浸潤(rùn)22 h，蒸16 h，中間品蒸制8 h。干燥即得。

Z27～Z28 樣品制法：依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版（一部），取何首烏塊100 kg、黑豆汁25 kg，拌勻上鍋蒸4 h，倒出翻蒸，上鍋再蒸3 h，取出、合并汁液，干燥。

Z29樣品制法：高壓蒸制。

Z30 樣品制法：原料凈制，洗藥機(jī)洗至無(wú)泥沙，浸泡2 h，燜潤(rùn)2～3 h；切至厚度為8～12 mm；溫度100 ℃，蒸4～6 h，至呈棕褐色，燜2 h；干燥溫度50～60 ℃，時(shí)間2～3 h，至水分不超過(guò)12%。

Z31～Z33 樣品制法：按照《中國(guó)藥典》2020 年版的工藝要求，用清蒸法，沒(méi)有加任何輔料。

2 方法與結(jié)果

2.1 《中國(guó)藥典》2020 年版何首烏【鑒別】（2）項(xiàng)下提取方式的優(yōu)化

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 取大黃素、大黃素甲醚、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制

2.1.2.1 《中國(guó)藥典》2020 年版制備方法 分別取何首烏藥材（S5、S8、S15、S16 和S19）和何首烏對(duì)照藥材，按《中國(guó)藥典》2020年版何首烏【鑒別】（2）項(xiàng)下供試品溶液制備方法，分別得到供試品溶液（HS5、HS8、HS15、HS16 和HS19）和對(duì)照藥材溶液（DZYC-H1）。

2.1.2.2 改進(jìn)方法 分別取何首烏藥材（S5、S8、S15、S16 和S19）粉末0.25 g，分別置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲20 min（功率：300 W，頻率：40 kHz），濾過(guò)，濾液濃縮至3 mL 作為供試品溶液（CS5、CS8、CS15、CS16 和CS19）。另取何首烏對(duì)照藥材0.25 g，同法制成對(duì)照藥材溶液（DZYC-C1）。

2.1.3 薄層色譜測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2020 年版薄層色譜法（通則0502），吸取2.1.2 項(xiàng)下2 種供試品溶液制備方法制得的溶液各2 μL，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品各0.5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)至約7 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。薄層色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)2種制備方式制得的樣品在相同的展開(kāi)條件下展開(kāi)結(jié)果并沒(méi)有明顯差異，因此可以用操作更加簡(jiǎn)單方便的超聲提取代替加熱回流作為樣品制備方式。

圖1 不同制備方法何首烏供試品薄層色譜考察

2.2 《中國(guó)藥典》2020 年版何首烏【鑒別】（2）項(xiàng)下展開(kāi)系統(tǒng)的優(yōu)化

2.2.1 對(duì)照品及供試品溶液制備 分別按照2.1.1、2.1.2.2 項(xiàng)下方法制備對(duì)照品及供試品溶液。點(diǎn)樣量分別為供試品和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷各2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚各0.5 μL，大黃素1 μL。

2.2.2 薄層色譜測(cè)定 采用3 種不同薄層色譜展開(kāi)系統(tǒng)：1）按《中國(guó)藥典》2020 年版方法，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)至約7 cm，取出，晾干。2）以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干。3）以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，其余條件按照2.1.3 項(xiàng)下方法。結(jié)果見(jiàn)圖2～4。展開(kāi)后發(fā)現(xiàn)，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)劑，對(duì)于何首烏中的不同極性的化合物都有較好的展開(kāi)效果，相較于三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，展開(kāi)后斑點(diǎn)明顯增多。

圖2 何首烏樣品按展開(kāi)系統(tǒng)（1）展開(kāi)結(jié)果

圖3 何首烏樣品按展開(kāi)系統(tǒng)（2）展開(kāi)結(jié)果

圖4 何首烏樣品按展開(kāi)系統(tǒng)（3）展開(kāi)結(jié)果

2.3 檢視條件考察

2.3.1 對(duì)照品及供試品溶液制備 分別按照2.1.1、2.1.2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品及供試品溶液。

2.3.2 薄層色譜測(cè)定 采用改進(jìn)后的2 種展開(kāi)系統(tǒng)（2）和（3），以硅膠G板展開(kāi)晾干后，分別考察噴與不噴10%硫酸乙醇顯色劑時(shí)，在日光燈和紫外燈（365 nm）下的斑點(diǎn)情況，結(jié)果見(jiàn)圖5～6。由石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)后噴以10%硫酸乙醇顯色劑并在紫外燈365 nm下檢視，斑點(diǎn)更為豐富和清晰。

圖5 何首烏樣品展開(kāi)系統(tǒng)（2）在日光燈和紫外光燈下檢視結(jié)果

2.4 薄層色譜鑒別方法的確定

圖6 何首烏樣品展開(kāi)系統(tǒng)（3）在日光燈和紫外光燈下檢視結(jié)果

基于供試品制備方式、展開(kāi)體系和檢視條件的考察，確定改進(jìn)后的薄層鑒別方法：1）取何首烏粉末0.25 g，按2.1.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下方法制備大黃素和大黃素甲醚對(duì)照品溶液，照薄層色譜法（通則0502），吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各2 μL，大黃素甲醚對(duì)照品溶液0.5 μL，大黃素對(duì)照品溶液0.1 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀。以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇顯色劑后，置紫外光燈（365 mn）下檢視。2）取何首烏粉末0.25 g，按2.1.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法制備2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各2 μL，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷各0.5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀。以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)劑，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇顯色劑，置紫外光燈（365 mn）下檢視。

3 何首烏和制何首烏樣品鑒別

3.1 何首烏樣品鑒別

取何首烏樣品（S1～S22），按2.4 項(xiàng)下薄層色譜鑒別方法，分別使用（1）和（2）條件進(jìn)行薄層色譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖7～8。

圖7 何首烏樣品按【鑒別】條件（1）檢測(cè)結(jié)果

圖8 何首烏樣品按【鑒別】條件（2）檢測(cè)結(jié)果

3.2 制何首烏樣品鑒別

取制何首烏樣品（Z1～Z34），按2.4 項(xiàng)下薄層色譜鑒別方法，分別使用（1）和（2）條件進(jìn)行薄層色譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖9～10。

圖9 制何首烏樣品按【鑒別】條件（1）檢測(cè)結(jié)果

4 討論

本研究共收集56 份樣品，其中生何首烏22 批，制首烏34 批。不同批次生何首烏藥材薄層檢視結(jié)果顯示，除貴州銅仁產(chǎn)何首烏外，其他所有產(chǎn)地何首烏藥材與對(duì)照藥材相比，主要成分斑點(diǎn)并無(wú)明顯差異，說(shuō)明何首烏樣品的一致性較好。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，何首烏中以大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為主的結(jié)合蒽醌具有潛在的肝毒性[14-16]。不同炮制工藝及不同炮制時(shí)間制首烏樣品薄層檢視結(jié)果顯示，隨炮制時(shí)間延長(zhǎng)，制首烏中結(jié)合蒽醌含量顯著下降，可能達(dá)到炮制減毒的效果，與本課題組前期對(duì)制何首烏中蒽醌類成分含量測(cè)定結(jié)果基本一致[5]。通過(guò)對(duì)黑豆蒸與清蒸工藝的考察，發(fā)現(xiàn)何首烏經(jīng)過(guò)36 h 的炮制后，結(jié)合蒽醌的含量大幅下降，且在薄層色譜鑒別中，基本觀察不到明顯的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌的主斑點(diǎn)，同制何首烏對(duì)照藥材溶液的薄層色譜圖基本一致。然而，本研究所收集的16 批制首烏樣品薄層檢視結(jié)果顯示，大部分樣品都有明顯的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌斑點(diǎn)，推測(cè)其炮制時(shí)間不足，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖10 制何首烏樣品按【鑒別】條件（2）檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于《中國(guó)藥典》2020 年版何首烏和制何首烏【鑒別】（2）收載的供試品提取方式，本研究嘗試以超聲提取替代原來(lái)的加熱回流提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者薄層展開(kāi)結(jié)果沒(méi)有明顯區(qū)別，因此選用更加簡(jiǎn)便的超聲提取作為供試品制備方式。與此同時(shí)，對(duì)于【鑒別】（2）收載的展開(kāi)系統(tǒng)，用低毒、易得的石油醚-乙酸乙酯-甲酸及二氯甲烷-甲醇-甲酸代替三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，所獲得的薄層色譜圖較《中國(guó)藥典》2020 年版何首烏和制何首烏項(xiàng)下薄層色譜條件更理想。因此，《中國(guó)藥典》2020 年版生和制何首烏【鑒別】（2）可采用超聲提取來(lái)替代加熱回流提取；采用石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)系統(tǒng)來(lái)鑒別生和制何首烏中大黃素和大黃素甲醚等游離蒽醌，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開(kāi)系統(tǒng)來(lái)鑒別生和制何首烏中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌及2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。改進(jìn)后的2 種薄層色譜鑒別方法對(duì)何首烏中主要成分2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蒽醌類成分（游離蒽醌及結(jié)合蒽醌）均具有較好的展開(kāi)效果，斑點(diǎn)清晰，且分離度較好，可有效用于生（制）何首烏藥材和飲片的鑒別。