李方正，李芹，吳莎莎，孫勝君，于海童，陳永升，牛慶亮*

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，在臨床、組織學(xué)和分子水平均表現(xiàn)出多樣性的特點[1-2]。Ki-67 是由MKI67 基因編碼的細胞核蛋白質(zhì)，Ki-67 指數(shù)即蛋白質(zhì)染色陽性細胞的百分比。一般情況下，Ki-67 指數(shù)越高，表明細胞分裂增殖越活躍、侵襲性越強[3]。對于Ki-67 高表達的乳腺癌分子亞型，需采取及時、強效的干預(yù)措施，以控制疾病進展。在臨床實踐中，乳腺癌術(shù)前腫瘤侵襲性的評估主要依靠穿刺活檢，通過局部組織的病理學(xué)檢測來評估Ki-67 的表達水平。然而，穿刺活檢為有創(chuàng)性檢查，且取材較為局限，往往難以獲取腫瘤組織的完整信息。因此如何能夠在治療前無創(chuàng)、精準(zhǔn)地評估乳腺癌的Ki-67表達狀態(tài)是十分有意義的臨床問題。

MRI具有高軟組織分辨率的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的診斷與療效評估中[4]。然而，傳統(tǒng)乳腺MRI需要采集多個序列，而且圖像的解讀主要基于不同組織的對比度，易受診斷醫(yī)生主觀經(jīng)驗的影響。此外，不同設(shè)備所采集的圖像差異較大，圖像標(biāo)準(zhǔn)化流程繁瑣，難以適用于多中心研究。合成MRI 是一種新型的成像方法，通過使用多回波和多延遲采集方法，一次掃描即可快速采集多種定量參數(shù)圖像[如T1-mapping、T2-mapping及質(zhì)子密度（proton density, PD）-mapping]并準(zhǔn)確量化組織的相應(yīng)定量參數(shù)值（如T1值、T2值以及PD 值）[5]。該技術(shù)已應(yīng)用于全身多個部位如大腦[6-9]、骨關(guān)節(jié)[10-11]、前列腺[12]及乳腺[13-14]等，有研究證明合成MRI 的臨床應(yīng)用具有較高的準(zhǔn)確性和較好的可重復(fù)性[15]。有研究分析得出合成MRI 相關(guān)定量參數(shù)圖的直方圖特征是鑒別乳腺浸潤性導(dǎo)管癌相關(guān)免疫組化指標(biāo)和分子亞型的潛在生物標(biāo)志物[16]。然而，合成MRI 定量參數(shù)圖的直方圖特征是否能夠用于無創(chuàng)性評估乳腺癌Ki-67的表達狀態(tài)尚不明確。因此，本研究的目的是評估合成MRI相關(guān)定量參數(shù)圖直方圖特征對乳腺癌Ki-67表達狀態(tài)的預(yù)測價值，并與傳統(tǒng)的表觀擴散系數(shù)（apparent diffusion coefficient,ADC）圖直方圖特征進行比較。

1 材料與方法

1.1 研究對象

該回顧性研究得到了濰坊市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，免除受試者知情同意（批準(zhǔn)文號：2021-02號）。本研究對自2019年12月至2021年3月期間在濰坊市中醫(yī)院就診的乳腺癌患者病例進行了評估。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI檢查前均未行臨床治療，檢查后1周內(nèi)行手術(shù)或穿刺術(shù)取得病理標(biāo)本；（2）經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)病理確診為乳腺癌；（3）MRI掃描序列完整，包括擴散加權(quán)成像（diffusion-weighted imaging,DWI）、動態(tài)對比增強MRI（dynamic contrast-enhanced MRI, DCE-MRI）和合成MRI；（4）乳腺癌患者均為女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）圖像有嚴重的偽影；（2）增強圖像病灶呈非腫塊型強化；（3）病灶最大徑＜1 cm。

1.2 MRI掃描方案

乳腺MRI掃描采用3.0 T MRI系統(tǒng)（SIGNA Pioneer,GE Healthcare），患者取俯臥位，雙乳自然下垂置于8 通道相控陣乳房表面線圈內(nèi)。依次進行常規(guī)軸位快速自旋回波（fast spin echo, FSE）T1WI序列、短時反轉(zhuǎn)恢復(fù)（short time inversion recovery, STIR）T2WI序列和DWI（b=0、800 s/mm2）序列、合成MRI序列及DCE-MRI序列（共8期）掃描。靜脈注射對比劑[釓雙胺注射液（歐乃影），GE藥業(yè)，愛爾蘭]，速率2 mL/s，劑量0.1 mmol/kg。各序列詳細掃描參數(shù)見表1。

表1 不同磁共振成像序列掃描參數(shù)Tab.1 Scan parameters of different magnetic resonance sequence

1.3 直方圖特征提取及MRI影像特征分析

MAGIC 的原始圖像數(shù)據(jù)使用SyMRI 8.0 軟件（SyntheticMRI, Link?ping, Sweden）處理以生成定量參數(shù)圖（T1-mapping、T2-mapping 和PD-mapping）（圖1A～1C）。為了清晰準(zhǔn)確地勾畫病灶邊界，我們首先對DCE-MRI 的第二期（病灶邊緣最明顯的峰值增強相）圖像與處理后的MAGIC圖像在MATLAB（MathWorks,Natick, MA）中進行配準(zhǔn)。然后兩位分別具有5 年和8 年乳腺影像診斷經(jīng)驗的主治醫(yī)師使用ITK-SNAP（http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php）軟件在配準(zhǔn)的DCE-MRI 圖像上手動逐層勾畫感興趣區(qū)（region of interest, ROI），最終得到3D-ROI（圖1D、1E），勾畫時盡量避開壞死、囊變及出血區(qū)域。當(dāng)同側(cè)乳腺存在多個腫塊時，評估最大的一個腫塊。兩位診斷醫(yī)師在勾畫ROI 時對臨床資料、病理結(jié)果和其他影像學(xué)檢查結(jié)果均不知曉。最后，應(yīng)用Pyradiomics 軟件提取定量參數(shù)圖T1-mapping、T2-mapping、PD-mapping 的直方圖特，包括10th位數(shù)、90th位數(shù)、均值、熵、峰度、偏度。在DWI（b=800 s/mm2）原始圖像上手工逐層放置ROI，將獲得的ROI 復(fù)制到ADC圖提取ADC圖的直方圖特征，方法同上（圖1F、1G）。

MRI 影像特征的評估也由同樣由以上兩位主治醫(yī)師進行，包括病灶最大徑（DCE-MRI 第二期測得）、形態(tài)（圓形或卵圓形、不規(guī)則形）、邊緣（光整、不光整）、強化方式（均勻、不均勻、環(huán)形強化）、纖維腺體類型（脂肪型、少量腺體型、多量腺體型、致密型）。

1.4 病理評估

病理結(jié)果判定，Ki-67 免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)細胞核表現(xiàn)為棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選10個高倍鏡視野（×400），計算平均陽性細胞數(shù)：陽性細胞數(shù)＜30%為低表達組，≥30%為高表達組（圖2）。ER、PR 染色陽性細胞比例大于1%記為陽性。免疫組織化學(xué)檢測顯示HER-2為3+記為陽性，1+或0記為陰性，如果HER-2 為2+，應(yīng)再進行熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization,FISH）檢測以明確HER-2 狀態(tài)，F(xiàn)ISH 結(jié)果陽性記為HER-2 陽性，F(xiàn)ISH 結(jié)果陰性記為HER-2陰性。

圖2 2A、2B 分別為乳腺癌Ki-67 低表達（10%）和Ki-67 高表達（80%）的病理圖片（×400）。Fig. 2 2A and 2B pathological pictures of breast cancer with low (10%)and high(80%)expression of Ki-67(×400).

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0、MedCalc和GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計作圖，定量參數(shù)圖及ADC圖的直方圖特征以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床及病理特征以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Shapiro-wilk檢驗符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（P25，P75）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗（independent samplet檢驗）或非參數(shù)檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）；計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法進行組間比較。將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的參數(shù)納入多因素logistic回歸分析，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線，并計算鑒別乳腺癌Ki-67表達狀態(tài)的曲線下面積（area under the curve,AUC）、敏感度、特異度及準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及病理免疫組化結(jié)果

146 例患者均為女性，年齡（49.86±9.83）歲，共147 個病灶，其中一例患者左、右乳各一個病灶。病理結(jié)果均為非特殊類型乳腺癌，其中浸潤性導(dǎo)管癌130例、浸潤性小葉癌4例、浸潤性導(dǎo)管癌伴導(dǎo)管原位癌11 例、浸潤性導(dǎo)管癌伴浸潤性小葉癌1 例，微乳頭狀癌1例。分子分型包括：Lumina A型29例，Lumina B型66例，HER-2過表達17例，三陰性（triple negative,TN）35 例。147 例乳腺癌病灶Ki-67 指數(shù)2%～95%，平均值39.86%±25.61%，其中低表達56例，高表達91例。

2.2 Ki-67 高表達組與低表達組患者的臨床、MRI 影像特征比較

Ki-67高表達組與低表達組間，患者的年齡、病灶最大徑、形態(tài)、邊緣、強化方式及纖維腺體類型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值范圍為0.09～0.94）（表2）。

表2 乳腺癌Ki-67高、低表達組臨床及MRI影像特征比較Tab.2 Comparison of the clinical and MRI characteristics of breast cancer between the high and low expression of Ki-67

2.3 Ki-67高、低表達間MRI相關(guān)定量參數(shù)比較

Ki-67 高表達組與低表達組間，T1-平均值（P＜0.001）、T1-10th位 數(shù)（P＜0.001）、T2-平 均 值（P=0.002）、T2-10th位數(shù)（P＜0.001）、PD-熵值（P=0.005）及PD-峰度（P＜0.001）的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中Ki-67高表達組的T1-平均值、T1-10th位數(shù)、T2-平均值、T2-10th位數(shù)和PD-峰度均大于Ki-67 低表達組，Ki-67 高表達組PD-熵值小于Ki-67 低表達組（表3）。Ki-67 高表達組與低表達組間，ADC 值的直方圖特征差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值范圍0.14 至0.96）。T1-平均值、T1-10th位數(shù)、T2-平均值、T2-10th位數(shù)、PD-熵值及PD-峰度區(qū)分Ki-67 高、低表達的AUC 值分別為0.69、0.75、0.68、0.74、0.63、0.67（表4）。

表3 Ki-67高、低表達組間合成MRI定量參數(shù)圖、ADC值直方圖特征比較Tab.3 Comparison of histogram features of synthetic MRI quantitative parameters and ADC values between the high and low expression of Ki-67

表4 Ki-67高、低表達組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的定量參數(shù)的診斷效能Tab.4 The diagnostic efficacy of quantitative parameters with statistical significance between the high and low expression of Ki-67

將以上差異有統(tǒng)計學(xué)意義的參數(shù)納入多因素logistic回歸分析得出，T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)是Ki-67表達狀態(tài)的獨立預(yù)測因素（表5）。采用箱式圖顯示T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)在Ki-67 高、低表達組間數(shù)據(jù)的差異（圖3）。聯(lián)合T1-10th位數(shù)、T2-10th位數(shù)建立logistic回歸模型進行診斷效能分析，得出AUC值為0.809（95%CI：0.737～0.869），敏感度為64.8%，特異度為87.5%，準(zhǔn)確度為72.8%（圖4）。

表5 區(qū)分Ki-67高、低表達組的多因素logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis to distinguish the high and low expression of Ki-67

圖3 T1-10th位數(shù)（3A）、T2-10th位數(shù)（3B）在Ki-67高、低表達組分布的箱式圖。Ki-67：細胞增殖指數(shù)；10th位數(shù)：第十百分位數(shù)。Fig.3 Box-whisker plot showing the T1-10th(3A),T2-10th(3B)percentile of the high and low expression of Ki-67.

圖4 合成磁共振定量參數(shù)圖直方圖特征聯(lián)合診斷模型預(yù)測Ki-67 高、低表達情況的ROC 曲線。Ki-67：細胞增殖指數(shù)；ROC：受試者工作特征。Fig.4 Receiver-operating characteristic (ROC) curve of predicting the high and low expression of Ki-67 by the combined diagnostic model of the histogram features of synthetic magnetic resonance imaging(SyMRI)quantitative parametric map.

3 討論

Ki-67 表達狀態(tài)是輔助乳腺癌分子分型、預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后及新輔助治療療效的重要指標(biāo)，可為臨床個體化精準(zhǔn)診療提供依據(jù)。本研究探討了乳腺癌合成MRI定量參數(shù)圖及ADC圖直方圖特征與Ki-67表達狀態(tài)的關(guān)系，研究得出T1-10th位數(shù)與T2-10th位數(shù)是預(yù)測Ki-67狀態(tài)的獨立預(yù)測因素,這為治療前精準(zhǔn)評估乳腺癌腫瘤細胞的增殖情況提供了一種新的輔助診斷方法。

3.1 合成MRI定量參數(shù)直方圖特征的臨床意義

合成MRI 是一種2D 自旋回波多動態(tài)多回波掃描技術(shù)，一次掃描即可獲得T1、T2、PD 三種定量參數(shù)圖像且可重建任意對比加權(quán)圖像。合成MRI 獲取的圖像顯示了僅基于單個組織參數(shù)的純對比度，并且由于內(nèi)部B1 場的校正，可以最大限度減少透射射頻場B1 對圖像的影響，這些特點為多中心研究提供了支持。與傳統(tǒng)的T1、T2、PD 定量方法相比，合成MRI 掃描可以減少長時間采集過程中可能出現(xiàn)的運動偽影等影響。本研究使用了3D-ROI 畫法，相對于以往在最大層面繪制ROI,可以獲取更加完整的腫瘤信息，從而更全面地反映病變的整體異質(zhì)性。另外，直方圖特征可以將影像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為具有高分辨率的可發(fā)掘的特征空間數(shù)據(jù)，之前乳腺腫瘤領(lǐng)域的直方圖特征大多基于DWI 或DCE-MRI 技術(shù)，基于合成MRI 定量參數(shù)圖的直方圖特征少有報道。

3.2 評估Ki-67高低表達狀態(tài)對于乳腺癌的重要性

Ki-67水平可以反映乳腺腫瘤的增殖情況[17]。腫瘤增殖活性越高者，Ki-67 指數(shù)越高。世界衛(wèi)生組織將Ki-67 小于14%的情況稱之為低表達，但是不同種族、地區(qū)、國家的患者及不同衛(wèi)生組織，Ki-67 水平高低的評定標(biāo)準(zhǔn)有所區(qū)別。有研究對1800例早期TNBC患者Ki-67最佳分界進行評估得出與預(yù)后最密切的臨界值是30%[18]。Sachiko等[19]將乳腺癌Ki-67以30%為界分為Luminal A型和Luminal B型。中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021 版）表明Ki-67 增殖指數(shù)的判定值在不同病理實驗中心可能有所不同，可采用20%～30%作為判斷Ki-67 高低的界值。2021 年乳腺癌Ki-67 國際工作組根據(jù)最新的評估標(biāo)準(zhǔn)將Ki-67＞30%定義為高表達[20]。根據(jù)本研究乳腺癌Ki-67 數(shù)據(jù)的表達情況并結(jié)合以上標(biāo)準(zhǔn)，將Ki-67≥30%定義為高表達，＜30%定義為低表達。Ki-67在乳腺癌的診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后判斷以及判斷新輔助化療療效等方面具有重要價值。目前臨床上Ki-67 增殖指數(shù)主要通過活檢或手術(shù)后取材標(biāo)本獲得，不僅為有創(chuàng)性檢查，且不能反映整個腫瘤的異質(zhì)性，準(zhǔn)確率還常受抽樣誤差的影響，另一方面Ki-67增殖指數(shù)是動態(tài)變化的[21]，活檢或手術(shù)后取材標(biāo)本的方法無法便捷、有效地反映Ki-67增殖指數(shù)的變化情況。

3.3 合成MRI定量參數(shù)T1值、T2值與乳腺癌Ki-67的關(guān)系

組織病理學(xué)是腫瘤影像學(xué)表現(xiàn)的基礎(chǔ)，因此MRI可以間接反映乳腺癌的免疫組織化學(xué)相關(guān)指標(biāo)的表達情況[22]。MRI 定量成像手段不僅能夠在術(shù)前無創(chuàng)反映腫瘤整體的異質(zhì)性，還可以進行多次動態(tài)評價，對指導(dǎo)臨床個性化診斷、治療及預(yù)后有重大意義。T1 值是組織的縱向弛豫時間，與組織含水量、水結(jié)合力和大分子濃度有關(guān)。以往T1定量值多用于評估心肌纖維化、肝纖維化以及膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，在乳腺癌Ki-67 表達方面的研究較少。Matsuda 等[23]對乳腺病變注射對比劑前、后的T1、T2和PD值及其標(biāo)準(zhǔn)差進行分析，發(fā)現(xiàn)注射對比劑后T1值的標(biāo)準(zhǔn)差是Ki-67表達的獨立預(yù)測因素，AUC值可達到0.885。此外，該研究團隊[15]還將乳腺病變注射對比劑前、后的T1、T2 和PD值及其差值和比值納入統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變注射對比劑前T1 值高于良性病變。本研究中，Ki-67高表達組的T1-平均值及T1-10th均高于Ki-67低表達組，分析認為可能與Ki-67 高表達組腫瘤呈高增殖，腫瘤細胞密度高、瘤內(nèi)更易出血、壞死有關(guān)。

T2 值反映的是人體組織自由水分子之間能量交換的能力，主要與自由水含量、蛋白多糖、膠原含量和排列方式有關(guān)。Jung等[24]報道合成MRI獲得的乳腺癌T2 弛豫時間與基于多回波自旋回波（multi-echo spin echo, MESE）T2-mapping的T2弛豫時間呈正相關(guān)，這說明合成MRI所測得的T2值同樣可反映機體組織的微觀變化。有研究認為當(dāng)惡性程度較高的腫瘤發(fā)生鄰近組織侵犯時，會分泌較多的透明質(zhì)酸酶，而透明質(zhì)酸酶具有延長橫向弛豫時間的屬性，是造成T2 值較高的原因[25]。本研究中Ki-67 高表達組的T2-10th高于低表達組，可能與Ki-67高表達組腫瘤組織增殖活性程度高及侵襲性強有關(guān)。

3.4 ADC值與乳腺癌Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性研究結(jié)果不一致

ADC 值能夠反映組織水分子擴散受限的程度。目前普遍認為細胞體積或特殊的空間排列以及細胞的密集程度是影響水分子運動的重要因素[26]。以往有研究表明ADC 值與Ki-67 指數(shù)呈負相關(guān)[27]，即Ki-67指數(shù)越高，細胞增殖越明顯，相應(yīng)地ADC值就越低。但也有研究顯示乳腺癌的ADC 值與Ki-67 無明顯相關(guān)性[28-29]。李芹等[30]研究浸潤性乳腺癌ADC 值與Ki-67 無顯著相關(guān)性，作者分析可能與病例中未排除非腫塊型病灶有關(guān)。由此可見，ADC 值與Ki-67 的相關(guān)性有待進一步研究。在本研究中，Ki-67 高、低表達組之間的ADC圖的直方圖特征之間沒有顯著差異，分析原因可能是由于乳腺癌基質(zhì)成分較復(fù)雜，癌灶內(nèi)可能存在的微鈣化及微液化壞死區(qū)對ADC 值的影響等因素有關(guān)。此外，乳腺癌新生血管豐富，血流灌注也可能成為影響ADC值的重要因素。

3.5 局限性及展望

本研究有一定的局限性：（1）本研究屬于單中心研究，未進行外部驗證；（2）本研究DWI 為單指數(shù)模型，相對于多b值DWI模型的研究[如體素內(nèi)不相干運動（intravoxel incoherent motion, IVIM）]，可能未完全排除微血管灌注對ADC 值的影響；（3）本研究未將最大徑＜1 cm 的乳腺癌病變納入分析，因此建立的模型對該類病變Ki-67表達狀態(tài)的預(yù)測效能尚不可知。下一步研究將會探討多b值DWI與乳腺癌免疫組化指標(biāo)的關(guān)系，并且對于＜1 cm的乳腺癌病變還需要進一步研究。

綜上所述，合成MRI定量參數(shù)圖的直方圖特征可以用于評估乳腺癌Ki-67的表達狀態(tài)，這為術(shù)前全面地預(yù)測乳腺癌的侵襲性提供了一種新的無創(chuàng)性方法。

作者利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。