許 磊

(四川省內(nèi)江市動植物疫病防控和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，四川 內(nèi)江 610200)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)代化、集約化和規(guī)?；a(chǎn)，獸藥添加劑的使用大大降低了動物的發(fā)病率和死亡率，提高了飼料利用率，使生產(chǎn)效率和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量得到顯著改善。然而，由于養(yǎng)殖人員缺乏科學(xué)知識以及過度追求經(jīng)濟(jì)利益，致使濫用獸藥的現(xiàn)象普遍存在。一方面濫用獸藥極易造成動物源食品中有害物質(zhì)的殘留，人體攝入后影響人類健康。另一方面獸藥會隨著養(yǎng)殖場排泄物的排放造成環(huán)境污染，給生態(tài)環(huán)境帶來極大危害[1]。

喹諾酮類藥物是一類化學(xué)合成的抗菌藥物，按發(fā)明先后及其抗菌性能不同，分為一、二、三、四代。其中第三代喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、吸收快、體內(nèi)分布廣泛和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，本代藥物分子中均有氟原子，因此也被稱為氟喹諾酮類藥物。氟喹諾酮類藥物進(jìn)入人體后部分敏感菌群會受到抑制，從而使人體內(nèi)微生物群的動態(tài)平衡遭到破壞，損害人類的身體健康。隨著生活水平不斷提高，人們越來越關(guān)注畜產(chǎn)品的品質(zhì)，希望享用綠色、無公害、低殘留的畜產(chǎn)品[2]。因此，畜產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物檢測成為畜產(chǎn)品檢測中最常規(guī)的檢測項(xiàng)目之一。本文將重點(diǎn)簡述動物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的危害及檢測方法。

1 氟喹諾酮類藥物殘留的危害

氟喹諾酮類藥物用藥量少，不能達(dá)到很好的疾病治療效果。用藥量大，不僅一定程度上加大動物本身病菌對其的抵抗能力，而且在動物體內(nèi)也會有部分殘留。人類在食用此類食品后，藥物就會轉(zhuǎn)移富集到人體內(nèi)，可能出現(xiàn)消化系統(tǒng)反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、過敏反應(yīng)、光敏反應(yīng)、心臟毒性、肝腎損害、軟骨損害、跟腱炎與腱斷裂等[3-4]。

1.1 消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)

胃和腸道反應(yīng)是氟喹諾酮類藥物進(jìn)入人體后最常見的不良反應(yīng)。人類在食用含有氟喹諾酮類藥物殘留的食品后，少量藥物不會引起明顯生理反應(yīng)，但隨著藥量的堆積，藥物會對胃和腸道造成刺激，表現(xiàn)為食欲減退、惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉及便秘等癥狀。如果攝入藥量過大，最嚴(yán)重的甚至?xí)鹣莱鲅?/p>

1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的發(fā)生率僅次于消化系統(tǒng)反應(yīng)。人類在食用含有氟喹諾酮類藥物殘留的食品后，藥物進(jìn)入人體，阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制介質(zhì)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)興奮，出現(xiàn)頭痛、頭暈、失眠、眩暈及情緒不安等癥狀，其中以失眠最為多見。當(dāng)攝入藥量過大，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)抽搐、幻覺、抑郁、精神異常等癥狀，但極為少見。

1.3 過敏反應(yīng)

過敏反應(yīng)主要發(fā)生在個(gè)別體質(zhì)特殊的人群身上，多表現(xiàn)為血管神經(jīng)性水腫、皮膚瘙癢、皮疹、蕁麻疹、皮炎等過敏癥狀，偶有出現(xiàn)過敏休克。

1.4 光敏反應(yīng)

光敏反應(yīng)是攝入氟喹諾酮類藥物后最特異的反應(yīng)，表現(xiàn)為手、顏面及其他暴露在陽光下的皮膚區(qū)域出現(xiàn)紅腫、瘙癢、灼熱感，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)中度紅斑或嚴(yán)重大皰疹。

1.5 心臟毒性

心臟毒性主要表現(xiàn)為Q-T間期延長和心率加快，雖然此類不良反應(yīng)罕見，但心臟毒性一旦發(fā)生，后果嚴(yán)重，甚至可威脅生命。

1.6 肝腎損害

肝功能的損害主要表現(xiàn)為使血清轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、血清淀粉酶和乳酸脫氫酶等升高，造成鞏膜和皮膚黃染、以及肝炎、膽汁滯留或肝衰甚至死亡。

1.7 軟骨損害

氟喹諾酮類藥物容易濃縮、沉積在骨髓中，損害軟骨細(xì)胞的發(fā)育，病損程度與年齡、藥物劑量、血藥濃度有關(guān)，年齡越小，損傷程度越重，因此對于孕婦和骨骼正在發(fā)育的兒童尤其要禁止攝入氟喹諾酮類藥物。

1.8 跟腱炎與腱斷裂

當(dāng)攝入氟喹諾酮類藥物后，肌腱中的所有蛋白質(zhì)均明顯減少，造成肌腱的組織損傷與軟骨病變，因此老年人和運(yùn)動員均應(yīng)避免攝入氟喹諾酮類藥物。

近年來，隨著人們生活水平不斷提高，動物源食品的安全問題也越發(fā)受到關(guān)注，因此，氟喹諾酮類藥物殘留的檢測也成為畜產(chǎn)品檢測中最重要的檢測項(xiàng)目之一。

2 氟喹諾酮類藥物殘留的檢測

2.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種較為常見的生物檢測分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)手段，與儀器分析技術(shù)相比具有方便、快捷、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能最大限度減少工作強(qiáng)度，通常用于藥物殘留的定性檢測，以及量值的初略計(jì)算，對于快速篩選具有重要意義[3]。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理 酶標(biāo)板微孔上預(yù)先包被了氟喹諾酮類抗原，樣品中殘留的氟喹諾酮類藥物和此抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)記物，催化底物顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中氟喹諾酮類藥物的含量。顯色深含量少，顯色淺含量多。

2.1.2 樣品前處理 用均質(zhì)器將樣品均質(zhì)混勻，稱取(1±0.05)g均質(zhì)后的樣品置于50mL離心管中，加入9.5mL去離子水、0.5mL 20倍濃縮樣品稀釋液，充分渦旋1min至組織完全分散。室溫下4000g以上離心10min，立即取50μL上清液進(jìn)行檢測。

2.1.3 樣品檢測 記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品對應(yīng)的酶標(biāo)板微孔編號，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都要做2孔平行，分別將50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到對應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，在每孔中加入50μL酶標(biāo)記工作液，再在每孔中加入50μL抗體工作液，輕輕振蕩混勻后，用蓋板膜蓋板后于常溫避光環(huán)境中放置30min。小心揭開蓋板膜，甩干微孔內(nèi)液體，用洗滌劑充分洗滌，吸水紙拍干。立即在每孔中加入100μL底物混合液，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋板后置于常溫避光環(huán)境中反應(yīng)15～20min。揭開蓋板膜，在每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩混勻10s，終止5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在波長450nm、630nm下進(jìn)行檢測，讀取酶標(biāo)板的吸光度值。

2.1.4 結(jié)果判定 將樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較再乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可粗略估算出樣品中氟喹諾酮類藥物的含量。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是一種新型高效準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，具有高靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等特點(diǎn)[3]。使用高效液相色譜法可以在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確計(jì)算出樣品中藥物殘留量，通常用于畜產(chǎn)品的定性定量檢測。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理 用磷酸鹽緩沖溶液提取樣品中的藥物，C18固相萃取柱凈化，磷酸-乙腈溶液洗脫后，用高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。

2.2.2 樣品前處理 用均質(zhì)器將樣品均質(zhì)混勻，稱取(2±0.05)g均質(zhì)后的試料置于50mL離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖溶液，10000r/min勻漿1min，中速振蕩5min，10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中。重復(fù)提取一次，離心后合并上清液，混勻，待凈化。C18固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸鹽緩沖溶液各2mL預(yù)洗，取待凈化溶液5mL過柱，用水1mL淋洗，真空抽干。用磷酸-乙腈溶液1mL洗脫，真空抽干，收集洗脫液。經(jīng)濾膜過濾后作為試樣溶液，用高效液相色譜儀測定。

2.2.3 樣品檢測 開啟高效液相色譜儀，設(shè)定好流速、檢測波長、柱溫、進(jìn)樣量等參數(shù)條件，將待測試樣溶液放入檢測盤中進(jìn)行檢測。

2.2.4 結(jié)果計(jì)算和判定 取試樣溶液和相應(yīng)的對照溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法就可計(jì)算出試料中藥物殘留量。計(jì)算結(jié)果和國家規(guī)定的該藥物限量值進(jìn)行比較，即可判定該樣品是否合格。

2.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有更高的分辨率和更低的檢出限，能更高效地完成檢測任務(wù)，滿足日常工作中的檢測要求，該方法逐漸成為獸藥殘留檢測的主要方法[3]。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理 樣品用1%乙酸乙腈溶液提取，旋蒸或氮?dú)饬飨聺饪s，磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，正己烷去脂后，經(jīng)C18固相萃取柱凈化，裝瓶，最后使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，得到樣品中殘留藥物的準(zhǔn)確含量。

2.3.2 樣品前處理 用均質(zhì)器將樣品均質(zhì)混勻，稱取(2±0.05)g適量混勻后的樣品置于50mL離心管中，加入1%乙酸乙腈溶液10mL，渦旋提取2min，10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中。重復(fù)提取1次，離心后合并上清液，40℃旋蒸至干或氮?dú)獯蹈伞?mL磷酸鹽緩沖溶液溶解殘?jiān)尤?mL正己烷，渦旋混合1min，10000r/min離心5分鐘，移去上層正己烷，下層溶液待凈化。分別用2mL乙腈、2mL磷酸鹽緩沖溶液活化和平衡C18固相萃取柱，將待凈化的溶液以自然滴液速度過柱，用2mL水淋洗，真空抽干。用1mL 0.1%乙腈/水溶液洗脫，真空抽干，收集洗脫液，過濾膜后用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.3.3 樣品檢測 啟動高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，分別設(shè)定好流速、進(jìn)樣體積、流動相梯度洗脫等液相色譜條件，及MRM特征離子、離子源溫度、掃描方式等質(zhì)譜條件，將待測試樣溶液放入檢測盤中進(jìn)行檢測。

2.3.4 結(jié)果判定 取試樣溶液、溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比定量，計(jì)算出試料中藥物殘留量。計(jì)算結(jié)果和國家規(guī)定的該藥物限量值進(jìn)行比較，即可判定該樣品是否合格。

隨著人們對食品安全的越發(fā)重視，獸藥添加劑的殘留受到極大關(guān)注，氟喹諾酮類藥物作為使用最普遍的獸藥種類之一，大量使用和濫用都會殘留在動物源食品中，殘留的藥物通過食品進(jìn)入人體，損害人體健康。為保障動物源食品安全，有效控制超標(biāo)食品流入市場，獸藥殘留檢測已成為最重要的監(jiān)測手段。