趙曉彤，曹武奎(通信作者)

天津市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 (天津 300192)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳乙肝密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷。疾病譜包括非酒精性單純性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。NAFLD不僅可導(dǎo)致肝病患者殘疾和病死，還與代謝綜合征、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病及結(jié)直腸腫瘤等高發(fā)疾病密切相關(guān)。目前，NAFLD已成為我國第一大慢性肝病和健康查體肝酶異常的首要原因，且越來越多的慢性乙型肝炎病毒感染患者合并NAFLD，嚴(yán)重危害患者的生命健康。同時(shí)，NAFLD也正成為世界肝病的主要病因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，NAFLD的全球流行率約為25%[1]。亞洲國家的NAFLD患病率約為27.4%[2]。據(jù)報(bào)道，肥胖(51.34%)、高脂血癥(69.16%)、高血壓(39.34%)和代謝綜合征(42.54%)的人群患有NAFLD的概率更高[3-5]。

NAFLD的典型臨床進(jìn)展路徑是：NAFLD—NASH—纖維化—肝硬化—肝功能衰竭—HCC。臨床發(fā)現(xiàn)高達(dá)50%的HCC病例可能發(fā)生在沒有肝硬化的情況下[6-7]。15%～20%的NAFLD患者可進(jìn)展為NASH，30%～40%的NASH患者可發(fā)展為纖維化，其中15%～20%的NASH患者可進(jìn)一步進(jìn)展為晚期纖維化(F3/F4期肝纖維化)或肝硬化(F4期肝纖維化)[8]。然而，NAFLD患者在沒有NASH的情況下也可能會(huì)發(fā)展為纖維化[9]。NAFLD與肝臟相關(guān)病死率、肝癌和總病死率的增加有關(guān)[5,10]。嚴(yán)重肝病的風(fēng)險(xiǎn)比隨著纖維化分期的增加而增加，而NASH不存在纖維化風(fēng)險(xiǎn)[11]。纖維化階段是NAFLD疾病特異度病死率的最強(qiáng)預(yù)測因子[12]。沒有其他組織學(xué)特征的纖維化階段可預(yù)測NAFLD的全因病死率和疾病特異度病死率[13]。晚期纖維化是導(dǎo)致NAFLD患者病死的獨(dú)立預(yù)測因子[14]。NAFLD病死率隨著纖維化分期的增加呈指數(shù)增加[15]。

因此，早期發(fā)現(xiàn)NAFLD患者纖維化對于控制與這種高度流行疾病相關(guān)的病死率至關(guān)重要。現(xiàn)對NAFLD的非侵入性血液生物標(biāo)記物的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以輔助臨床診斷。

1 單項(xiàng)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

肝纖維化是一種由各種原因(肝炎、毒素、游離脂肪酸等)引起的自然傷口愈合反應(yīng)，可引起炎癥和肝細(xì)胞損傷。肝纖維化主要的細(xì)胞過程包括激活肝星狀細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，肝細(xì)胞的減少，細(xì)胞外基質(zhì)和纖維膠原的積累。參與這些過程的分子可作為生物標(biāo)志物，包括蛋白質(zhì)、微小核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和長非編碼RNA。參與調(diào)節(jié)纖維化形成的生物標(biāo)志物在輔助診斷肝纖維化中的應(yīng)用效果優(yōu)于僅僅是纖維化最終結(jié)果的指示物(如膠原蛋白等)。

1.1 多花紫藤凝集素陽性mac-2結(jié)合蛋白(wisteria floribunda lectin mac-2-binding protein，WFA+-M2BP)與Ⅳ型膠原氨基末端肽(7S)

Ogawa等[16]檢測了WFA+-M2BP和Ⅳ型膠原7S在165例NAFLD患者中的表達(dá)情況，經(jīng)肝活檢發(fā)現(xiàn)呈顯著纖維化表現(xiàn)；以0.83 ng/ml為臨界值時(shí)，血清WFA+M2BP診斷纖維化階段≥2期的曲線下面積為0.832(95%可信區(qū)間為0.771～0.894)；以5.2 ng/ml為臨界值時(shí)，血清Ⅳ型膠原7S診斷纖維化階段≥2期的曲線下面積為0.837(95%可信區(qū)間為0.778～0.898)；使用上述截?cái)嘀?，WFA+-M2BP確診了73.2%的顯著纖維化患者，Ⅳ型膠原7S確診了80.5%的顯著纖維化患者，其中62.2%的患者WFA+-M2BP和Ⅳ型膠原7S均超過閾值。

WFA+-M2BP是紫藤凝集素陽性Mac-2結(jié)合蛋白，又被命名為M2BPGi，即Mac2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體。Mac-2結(jié)合蛋白的官方基因名稱是半乳凝素3結(jié)合蛋白(galectin 3 binding protein，LGALS3BP)(www.genecards.org)。糖蛋白可能是肝纖維化的潛在生物標(biāo)志物，是否可將更多的糖蛋白作為纖維化的生物標(biāo)志物有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并證實(shí)。

1.2 幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1(chitinase-3-like-1 protein，CHI3L1)和Ⅳ型膠原7S

CHI3L1是一種含383個(gè)氨基酸，分子量為42.6KD的單體糖基化蛋白，為糖基水解酶家族成員之一，其可結(jié)合殼多糖，但無殼多糖酶的活性，在炎癥和組織重塑中起著重要作用。CHI3L1最初被認(rèn)定為乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒患者纖維化的生物標(biāo)志物[17-21]。Kumagai等[22]發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清CHI3L1水平會(huì)隨著肝纖維化程度的加重而升高。

CHI3L1的優(yōu)勢在于其與NAFLD患者的脂肪變性、炎癥、細(xì)胞膨脹等均無相關(guān)性。當(dāng)與Ⅳ型膠原7S結(jié)合使用算法[-0.0545+Ⅳ型膠原7S×0.3456+CHI3L1×0.0024]，截?cái)嘀禐?.06時(shí)，曲線下面積增加到0.8763[22]。CHI3L1被包括在NIS4算法中使用α-2-巨球蛋白、微小基因(microgene，MIR)34a、CHI3L1和糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)來識(shí)別需要治療的NAFLD患者[23]。此外，HbA1c與NAFLD患者的纖維化進(jìn)程有關(guān)[23]。當(dāng)HbA1c水平≥8.0%時(shí)，NAFLD患者的肝纖維化概率會(huì)增加，當(dāng)HbA1c水平≥6.5%時(shí)，則與潛在的肝纖維化顯著相關(guān)[24]。

1.3 血清細(xì)胞角蛋白18片段(cytokeratin18，CK18-F)

CK18-F可作為NAFLD的非侵入性生物標(biāo)志物[25]。血清CK18-F水平與脂肪變性、炎癥、細(xì)胞膨脹以及整體NAFLD活動(dòng)評分密切相關(guān)。以230 U/L為臨界值時(shí)，CK18-F預(yù)測NAFLD的曲線下面積為0.762、靈敏度為0.89、特異度為0.65；以270 U/L為臨界值時(shí)，CK18-F預(yù)測NASH的曲線下面積為0.757、靈敏度為0.64、特異度為0.76。對于NAFLD相關(guān)性肝纖維化的分期，CK18-F僅在F0和F1之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0102)，而在F1、F2、F3和F4之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[25]。

1.4 金屬蛋白酶組織抑制因子-1

Yilmaz和Eren[26]的研究發(fā)現(xiàn)，有明顯纖維化的NAFLD患者僅金屬蛋白酶組織抑制因子-1水平顯著高于無纖維化的NAFLD患者(P=0.03)。

1.5 胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(Insulin like growth factor binding protein 5，IGFBP5)

Colak等[27]發(fā)現(xiàn)，中、重度纖維化患者血清IGF-1濃度明顯低于無纖維化或輕度纖維化的患者(P=0.001)；以63.6 mg/L為臨界值，曲線下面積為0.85、靈敏度為75%、特異度為91%；此外，中、重度纖維化患者的血清IGFBP5水平明顯高于無纖維化或輕度纖維化的患者(P=0.028)；以630.1 mg/L為臨界值，曲線下面積為0.74、靈敏度為75%、特異度為80%。

1.6 Ⅲ型前膠原氨基端肽(type Ⅲ procollagen amino peptide，PⅢNP)

PⅢNP是鑒別不同程度NASH的良好標(biāo)記物[28]。然而，PⅢNP作為區(qū)分不同程度纖維化的標(biāo)記物并不理想，區(qū)分F0與F1～2的曲線下面積為0.63，區(qū)分F0～1與F2的曲線下面積為0.65。

1.7 白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)

血清IL-8、骨橋蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白1與NAFLD患者的肝纖維化相關(guān)。在控制了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、糖尿病、高血壓和代謝綜合征狀態(tài)后，發(fā)現(xiàn)IL-8與肝纖維化程度呈顯著相關(guān)性(P=0.001)[29]。

1.8 循環(huán)長鏈非編碼RNA lnc18q22.2

Atanasovska等[30]對來自NASH(48例)、單純脂肪變性但無NASH(11例)和健康對照(23名)的82例肝活檢標(biāo)本進(jìn)行了4 383個(gè)長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)肝臟特異的lncRNA(lnc18q22.2，RP11-484N16.1)，其與NASH分級(r=0.51，P=8.11×10-7)、小葉性炎癥(r=0.49，P=2.35×10-6)以及非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)性評分(r=0.48，P=4.69×10-6)相關(guān)。然而，是否能在血液中檢測到這種lncRNA以及將其作為NALFD肝纖維化生物標(biāo)志物的性能還有待進(jìn)一步研究。

1.9 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)的血漿脫氧核糖核酸(deoxyriboNucleic acid，DNA)甲基化

當(dāng)PPARγ基因啟動(dòng)子甲基化閾值為81%時(shí)，可將26例經(jīng)活檢證實(shí)的NAFLD患者分成輕、重度兩組，其曲線下面積為0.91，靈敏度和特異度分別為0.83和0.93[31]。

2 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物

肝巨噬細(xì)胞通過與肝星狀細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞相互作用，在炎癥和纖維化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。因此，通過關(guān)注巨噬細(xì)胞相關(guān)因子來探索可行的肝纖維化生物標(biāo)志物是合理的。巨噬細(xì)胞相關(guān)因子主要包含白細(xì)胞介素-34、唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素7(Sialic acid binding immunoglobulin like lectin 7，sSiglec7)和可溶性CD163分子(Soluble CD163 molecule，sCD163)。在NAFLD患者的肝臟中，白細(xì)胞介素-34由活化的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，sSiglec7由巨噬細(xì)胞分泌，sCD163是白細(xì)胞介素-6誘導(dǎo)的清除結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的巨噬細(xì)胞受體，在巨噬細(xì)胞上表達(dá)，并在巨噬細(xì)胞激活后上調(diào)。Soshio和Kanto[32]發(fā)現(xiàn)，血清白細(xì)胞介素-34、CHI3L1和sSiglec7水平與肝纖維化密切相關(guān)，可作為NAFLD/NASH的診斷生物標(biāo)志物。另外，在慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染和NAFLD患者中，sCD163水平與纖維化分期相關(guān)。在NAFLD患者中，sCD163在肝臟的表達(dá)與脂肪變性的程度相關(guān)。這些標(biāo)記物檢測晚期肝纖維化的靈敏度和特異度各不相同，能分別對NAFLD患者的晚期纖維化，輕、中度纖維化，HCC提供診斷依據(jù)。建議將這些標(biāo)記物與其他方式相結(jié)合以輔助診斷。

3 其他相關(guān)標(biāo)志物

目前，NAFLD患者纖維化分期的評估方案是使用生物標(biāo)記物將患者大致分為無、中度(F0～2)或重度(F3～4)纖維化。從更廣泛的公共衛(wèi)生角度來看，這可能足以識(shí)別和分層患者，以便更好地對NAFLD患者進(jìn)行臨床管理或治療。另一方面，在來自患者的活檢樣本中，僅因采樣錯(cuò)誤，導(dǎo)致纖維化診斷錯(cuò)誤超過一個(gè)分期的發(fā)生率高達(dá)33.1%[33]。然而，期望生物標(biāo)記物的表現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于活檢本身的準(zhǔn)確度是不現(xiàn)實(shí)的，活檢本身的準(zhǔn)確度為70%～80%，這取決于醫(yī)院設(shè)備或病理學(xué)家的技術(shù)水平?，F(xiàn)在亟需創(chuàng)新一種方法以取代活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，并提出新的指標(biāo)來評估纖維化生物標(biāo)記物，或者建立全新的標(biāo)準(zhǔn)，如測量纖維化進(jìn)展的速度和方向，而非強(qiáng)制進(jìn)行靜態(tài)的纖維化分期。比較折中的辦法是限制(或集中)生物標(biāo)記物的應(yīng)用范圍，以此作為輔助判斷依據(jù)，以最大限度地減少活檢次數(shù)。在這種情況下，具有高陽性預(yù)測值或高陰性預(yù)測值的生物標(biāo)志物檢測可幫助識(shí)別不需要活檢的患者。此外，循序漸進(jìn)的算法似乎比同時(shí)使用所有生物標(biāo)志物作為綜合得分的算法的效果更好[34-35]。蛋白質(zhì)組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等新技術(shù)可能會(huì)為評估纖維化分期或進(jìn)展速度提供進(jìn)一步的創(chuàng)新[36]。

4 小結(jié)

廣泛的基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)為肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展和癌變的機(jī)制提供了有用的信息。NAFLD是一個(gè)日益增長的全球公共衛(wèi)生問題，需要公共衛(wèi)生診斷、系統(tǒng)科學(xué)、營養(yǎng)、肝病和臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者進(jìn)行長期研究。目前，針對NAFLD纖維化的標(biāo)志物眾多，包括WFA+-M2BP、CHI3L1、CK18-F、IGF-1等單項(xiàng)生物標(biāo)志物，以及白細(xì)胞介素-34、sSiglec7、sCD163等巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物等。根據(jù)無創(chuàng)篩查肝纖維化相關(guān)的標(biāo)志物，可對NAFLD進(jìn)行早期評估，對控制NAFLD患者的病死率具有重要的臨床意義。