李強(qiáng)強(qiáng)，謝亞?wèn)|，楊國(guó)清 ，梁文強(qiáng)，張懷斌，王勇平

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院骨科，蘭州 730030)

骨髓由非貼壁的造血細(xì)胞和貼壁的基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，其中貼壁的基質(zhì)細(xì)胞包含多能間充質(zhì)干細(xì)胞、分化的骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞主要依賴增殖分化完成自我更新，其具有多向分化潛能[1-2]，在特定誘導(dǎo)條件下，可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分化[3]。如何定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化非常重要，其可為骨折修復(fù)、骨組織工程、骨質(zhì)疏松等提供治療方法。骨缺損、骨損傷屬于骨科常見疾病，通常需要植骨治療。植骨治療包括異體骨移植修復(fù)和自體骨移植修復(fù)，其中自體骨移植療效較好，不存在免疫反應(yīng)，但自體骨供應(yīng)受到一定限制；同種異體骨移植修復(fù)的缺點(diǎn)為移植骨存在免疫原性和致病性，最終導(dǎo)致骨損傷修復(fù)難以獲得滿意效果。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，可選擇一系列誘導(dǎo)方式促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化成多類組織細(xì)胞，且細(xì)胞免疫原性較弱，極易轉(zhuǎn)染外源基因，成為組織工程研究的熱點(diǎn)，同時(shí)其也在基因與細(xì)胞治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。鑒于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在以上諸多優(yōu)點(diǎn)，其有望成為骨缺損修復(fù)的理想種子細(xì)胞。現(xiàn)就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

20世紀(jì)60年代有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，骨髓中不僅有造血干細(xì)胞，還包含非造血系統(tǒng)多向分化的干細(xì)胞[5-6]。隨著學(xué)者對(duì)骨髓基質(zhì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)可隨著造血干細(xì)胞系統(tǒng)一同成長(zhǎng)，并能夠完成自我更新，在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或脂肪細(xì)胞等間充質(zhì)組織細(xì)胞群，因此將這類貼壁生長(zhǎng)的骨髓單核細(xì)胞稱作骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[7]。另有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)源于間質(zhì)系統(tǒng)的多能干細(xì)胞，其與造血干細(xì)胞共同分布在骨髓內(nèi)，并保證骨髓的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定[8]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨髓中常見的非造血干細(xì)胞，在體內(nèi)外均可達(dá)到支撐與調(diào)控造血的目的[9]。有學(xué)者指出，若骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺失或功能受損，機(jī)體發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高[10]，其原因可能為：①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、活力可隨著年齡增長(zhǎng)而不斷減少和降低；②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞喪失對(duì)周邊調(diào)節(jié)信號(hào)的反應(yīng)能力；③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微生態(tài)環(huán)境受到影響，從而引發(fā)功能失衡；④免疫調(diào)節(jié)能力異常；⑤分化功能衰退等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，最初在骨髓內(nèi)發(fā)現(xiàn)，隨后在臍帶血、脂肪組織、胚胎組織、外周血以及肝臟內(nèi)也發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存在。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便、體外培養(yǎng)增殖能力較強(qiáng)、極易定向分化為成骨細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)，特別是自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其可抑制T細(xì)胞增殖，具有預(yù)防免疫應(yīng)答、降低免疫原性的作用，是目前臨床較為理想的骨種子細(xì)胞。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材較為簡(jiǎn)便，但在骨髓中含量較低。研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞僅占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.000 1%～0.01%[11]，因而難以滿足組織工程種子細(xì)胞的需求，往往需要通過(guò)體外分離純化才能達(dá)到大量擴(kuò)增的效果。

目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方式較多，有流式細(xì)胞術(shù)分選法、免疫磁珠法、密度梯度離心法、全骨髓貼壁法等，其中流式細(xì)胞術(shù)分選法和免疫磁珠法可通過(guò)熒光、磁珠標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原，具備操作簡(jiǎn)便、分選快速、精確度高等優(yōu)勢(shì)，但在分選期間可能導(dǎo)致細(xì)胞受損或死亡，加上儀器設(shè)備較為昂貴，操作期間需要的細(xì)胞數(shù)量較多，因此在臨床的應(yīng)用受到限制[12]。密度梯度離心法雖然操作簡(jiǎn)便，但極易導(dǎo)致原始骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境受損，因此難以形成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞集落。全骨髓貼壁法對(duì)細(xì)胞的傷害較小，且細(xì)胞增殖速度較快，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)可獲得具有較高活性和純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，故成為臨床較為常見且簡(jiǎn)單便捷的體外培養(yǎng)方式之一[13-14]。

2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法較多，但尚未統(tǒng)一，目前多采用免疫熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)，同時(shí)也可選擇倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，從而達(dá)到輔助鑒別骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在多種表面抗原，但缺少特異性表面標(biāo)志物。由于骨髓內(nèi)包含造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通常僅表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105等表面標(biāo)志物，不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD14、CD45、CD19、CD34及白細(xì)胞相關(guān)抗原[15-17]。因此利用流式細(xì)胞術(shù)給予熒光標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞分選，有助于與造血干細(xì)胞區(qū)分[18-19]。另外還可根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能進(jìn)行間接鑒定，在特定的誘導(dǎo)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化[3]。綜上，可將細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、多向分化能力三者結(jié)合鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響因素

隨著研究的不斷深入，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增與鑒定技術(shù)均取得了較大的進(jìn)展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化主要依靠成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成成分包括地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉，三者存在劑量與時(shí)間相關(guān)性[20]。目前影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的因素較多，主要包括化學(xué)因素(成骨細(xì)胞培養(yǎng)基、枸橘苷、淫羊藿苷、駱駝蓬堿等)、生物因素(骨形態(tài)發(fā)生蛋白、前列腺素E2受體選擇性激動(dòng)劑等)、物理因素(電磁場(chǎng)、沖擊波等)以及生物材料(纖維增強(qiáng)復(fù)合水凝膠納米復(fù)合材料、多孔硅酸鈣陶瓷材料、醫(yī)用鎂合金材料等)[21]。

3.1生物材料 近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，生物材料在骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)中具有重要意義，同時(shí)還可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖分化[22]。有研究將鍶元素置于多孔硅酸鈣陶瓷材料離子提取物中與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，多孔硅酸鈣陶瓷材料產(chǎn)生的硅、鍶元素可明顯提升骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨基因、信使RNA的表達(dá)水平[23]。目前用于骨科植入的生物修復(fù)材料主要分為高分子材料和金屬材料兩大類，其中金屬材料有不銹鋼、鈦合金、鈷基合金、鐵基合金等，但這些金屬材料長(zhǎng)期置入宿主體內(nèi)易與周圍組織發(fā)生電解質(zhì)腐蝕，產(chǎn)生不良反應(yīng)和局部炎癥，造成生物相容性差，發(fā)生骨溶解[24]。以上缺陷無(wú)論發(fā)生哪一種，均可導(dǎo)致骨損傷修復(fù)效果不佳，甚至失敗。高分子材料包括生物陶瓷和天然聚合物，由于它們?cè)谏飳W(xué)性能及結(jié)構(gòu)上與宿主機(jī)體結(jié)構(gòu)存在一定差異，骨損傷修復(fù)效果不佳。因此，急需開發(fā)一種新型醫(yī)用骨修復(fù)材料，以滿足臨床需求。

近年來(lái)，醫(yī)用新型生物材料鎂合金成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，鎂離子能促進(jìn)骨細(xì)胞形成并加速骨組織愈合，且參與機(jī)體多種酶的活化、蛋白質(zhì)合成、肌肉收縮等[25]。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，置入鎂金屬內(nèi)植物與宿主不會(huì)發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，且能促進(jìn)骨折斷端骨痂形成，但純鎂材料腐蝕速率過(guò)快，無(wú)法達(dá)到人體支持骨折愈合需求，而鎂金屬合金的機(jī)械完整性和耐腐蝕性均優(yōu)于純鎂[26]。鎂合金是一種新型金屬材料，其可作為心腦血管支架材料以及骨科植入材料[27]，目前關(guān)于鎂合金對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為影響的相關(guān)報(bào)道較少。鎂合金在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中具有重要意義，與其他生物金屬材料相比，鎂合金具有可降解性，與機(jī)體有較好的生物相容性，且具有骨整合、促進(jìn)骨生成的作用。

鎂具備一定降解性、生物相容性和力學(xué)性能，鎂或鎂合金作為骨科新型內(nèi)植物材料，在骨再生的關(guān)鍵細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，純鎂在機(jī)體中的降解速度較快，可直接降低治療效果，加入鋁、硅、鈣或錳等金屬元素后，可提升鎂金屬的耐降解性[28]，且不會(huì)增加不良反應(yīng)，同時(shí)還可改善與機(jī)體內(nèi)組織的相容性[29]。研究發(fā)現(xiàn)，鎂合金表面具有一定黏附性能，隨后對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，鎂合金浸提液可能對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，但若能夠進(jìn)行微弧氧化表面改性，則可有效降低鎂合金對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用[30]。Lee等[31]對(duì)鎂合金的生物學(xué)性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，鎂合金材料均存在一定的細(xì)胞毒性，對(duì)其浸提液進(jìn)行pH值調(diào)整發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性較好。在骨科可利用鎂合金制備成界面螺釘置于機(jī)體中，利用鎂合金的降解性與骨整合功效促進(jìn)骨愈合，同時(shí)減少翻修手術(shù)的次數(shù)，降低對(duì)患者的傷害，為快速穩(wěn)定病情提供保障[32]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將鎂合金置于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，利用掃描電鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，鎂合金表面有大量細(xì)胞依附，且生長(zhǎng)狀態(tài)較好，提示鎂合金有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)，進(jìn)而誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞的成骨分化，達(dá)到骨誘導(dǎo)目的[33]。研究發(fā)現(xiàn)，加入適量的鎂合金浸提液可使成骨分化的標(biāo)志物堿性磷酸酶的表達(dá)水平明顯升高，而骨橋蛋白基因表達(dá)水平也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)[34]，但關(guān)于鎂合金對(duì)成骨分化基因表達(dá)作用的影響還需進(jìn)一步研究。

目前，鎂合金作為內(nèi)植物應(yīng)用于骨科還有很多問(wèn)題需要解決，其中最主要的問(wèn)題為鎂合金降解速率的不可控性。有效解決的方法包括：①表面涂層，如磷酸鈣涂層和羥基磷灰石涂層，其應(yīng)用廣泛，涂層后鎂合金降解速率控制效果顯著；②改善鎂合金成分，特定金屬元素與鎂合金化，金屬元素通過(guò)結(jié)合反應(yīng)提升材料的強(qiáng)度、耐腐蝕能力以及降低合金材料降解速率。但上述研究均處于實(shí)驗(yàn)階段，鎂及鎂合金作為適宜的骨內(nèi)固定物材料需滿足一定的力學(xué)強(qiáng)度要求，且降解過(guò)程可控并允許骨長(zhǎng)入，利于骨折愈合，故未來(lái)還需深入研究。

3.2其他 近年隨著中醫(yī)技術(shù)的迅猛發(fā)展發(fā)現(xiàn)，部分中藥成分能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)有助于修復(fù)骨缺損。報(bào)道顯示，淫羊藿苷+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠共同促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[35]；補(bǔ)骨脂素+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基可通過(guò)調(diào)節(jié)骨鈣素、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[36]。富血小板血漿可有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化。研究顯示，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入富血小板血漿可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，且誘導(dǎo)成功的成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色強(qiáng)陽(yáng)性，成骨分化相關(guān)蛋白(如骨橋蛋白)信使RNA表達(dá)增加[37]。此外，激素在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖分化中也具有較重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，向成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入17β-雌二醇，成骨分化過(guò)程中堿性磷酸酶的表達(dá)水平明顯升高[38]。

4 成骨細(xì)胞的鑒定

目前對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后分化形成的成骨細(xì)胞主要依據(jù)成骨細(xì)胞的特征鑒定，如分泌Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶以及是否形成礦化結(jié)節(jié)等。其中對(duì)于堿性磷酸酶，可利用改良鈣鈷法染色鑒定。研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后堿性磷酸酶可出現(xiàn)明顯升高的現(xiàn)象，使用改良鈣鈷法染色后礦化位置可見棕黑色或黑色沉淀或結(jié)節(jié)[39]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)化學(xué)染色后，其第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨標(biāo)志物CD54、CD44及纖連蛋白抗原抗體反應(yīng)呈陽(yáng)性，而陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕色或棕褐色，廣泛分布在胞質(zhì)內(nèi)，尤其是胞核周邊，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有成骨分化的潛能[40]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，學(xué)者采用免疫組織化學(xué)測(cè)定成骨標(biāo)志物——骨連接素、骨橋素的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，胞質(zhì)中存在較多棕黃色顆粒，提示成骨誘導(dǎo)分化成功[41]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系作用2周后，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色后顯示陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)顯示棕褐色，而Ⅲ型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示陰性反應(yīng)，說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化后主要分泌Ⅰ型膠原蛋白[42]。骨鈣素又稱為γ-羥基谷氨酸蛋白，常被作為成熟的成骨細(xì)胞合成維生素K依賴酶修飾的骨非膠原蛋白，在成骨細(xì)胞表型發(fā)育期間，骨鈣素的表達(dá)顯示發(fā)育階段特異性，故其僅在基質(zhì)礦化期開始后表達(dá)。

5 結(jié) 語(yǔ)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可用于組織工程、干細(xì)胞移植、骨缺損修復(fù)、骨質(zhì)疏松癥以及骨折不愈合等，具有較大價(jià)值。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源較少且缺乏分離純化方法，目前亟須建立一種體外分離純化方式，以達(dá)到大量擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的方式較多，如何選擇一種穩(wěn)定并可在臨床推廣使用的方式還需進(jìn)一步研究；利用生物材料復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨填充材料治療骨缺損的研究取得了一定進(jìn)展，但是由于生物材料存在降解速率過(guò)快、生物學(xué)性能不穩(wěn)定、骨組織不匹配、不能建立有效的連接血供等缺陷，仍需多方面深入研究。