郭雪然,賀程威,高 晗,華嶸暄,梁 宸,杜奕萱,尚宏偉,路 欣,徐敬東

郭雪然,梁宸,首都醫(yī)科大學(xué)2019級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 北京市 100069

賀程威,高晗,徐敬東,首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系 北京市 100069

華嶸暄,首都醫(yī)科大學(xué)2020級臨床醫(yī)學(xué)“5+3一體化” 北京市 100069

杜奕萱,首都醫(yī)科大學(xué)2020級口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)“5+3一體化” 北京市100069

尚宏偉,路欣,首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教學(xué)實驗室 北京市100069

0 引言

隨著人類對腸道黏膜免疫系統(tǒng)以及炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)易感性的研究的不斷完善,越來越多的證據(jù)表明腸道微生物在調(diào)節(jié)人體健康中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.宿主和腸道菌群相互作用,共同維持腸黏膜屏障的功能,調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[1],當腸道微生物中致病菌和正常菌群比例失調(diào)[2],致病菌增多可導(dǎo)致腸上皮通透性增高、黏膜免疫失調(diào)、影響腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs)的能量代謝與正常IECs結(jié)構(gòu)和功能,誘發(fā)腸道炎癥.目前,腸道微生物代謝產(chǎn)物與宿主之間的相互調(diào)節(jié)作用成為科學(xué)家們研究的焦點.腸道微生物代謝產(chǎn)物,特別是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)能夠促進腸黏膜屏障對多種微生物信號的整合.腸黏膜屏障通透性改變、功能障礙以及微生物群失調(diào)等均是IBD等炎癥性腸道疾病的誘因,而探索其作用機制目前成為了研究熱點.本篇綜述將就SCFAs通過調(diào)節(jié)腸黏膜屏障來緩解IBD的作用機制做出闡述.

1 IBD患者的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFAs

IBD是累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種特發(fā)性腸道炎癥疾病,以慢性炎癥反應(yīng)和胃腸道上皮為主要特征,主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)[3].眾所周知,IBD的發(fā)生可能與遺傳、免疫、微生物和環(huán)境等多重因素相互作用有關(guān)[4],其發(fā)生機制尚不明確,但普遍認為,IBD的發(fā)生可能與個體腸道內(nèi)菌群失調(diào)有關(guān).腸道菌群能夠抵抗病原菌的侵襲,當腸道菌群和黏液層之間的穩(wěn)態(tài)受到外來因素的影響時,引起腸黏膜屏障功能的改變以及黏膜傷口的出現(xiàn).腸上皮屏障功能受損及黏膜傷口愈合不足或延遲是IBD發(fā)展和持續(xù)的因素.腸黏膜屏障能使營養(yǎng)物質(zhì)選擇性通過并抵抗有害物質(zhì)進入,黏膜傷口的修復(fù)由上皮細胞和浸潤型免疫細胞及其介質(zhì)的動態(tài)串擾進行協(xié)調(diào),參與修復(fù)、增殖和分化等復(fù)雜機制的調(diào)控,還依賴于免疫應(yīng)答、介質(zhì)之間的相互作用等一系列事件進行調(diào)控[5,6].通過重建腸黏膜屏障、調(diào)控其轉(zhuǎn)運作用并促進黏膜傷口的愈合來治療IBD或?qū)⒊蔀樨酱_發(fā)的新療法[7].

新一代測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展使人們更易識別IBD患者中腸道微生物群組成的變化.利用宏基因組測序可以揭示微生物群的功能潛力.IBD患者的糞便微生物中,擬桿菌屬、厚壁菌屬、普拉氏梭菌和人羅斯拜瑞氏菌減少,而放線菌屬和變形桿菌屬增加,促炎細胞因子水平升高,促進腸道炎癥的發(fā)展[8,9];在黏膜組織和糞便采樣中,CD患者的巴斯德桿菌、韋榮氏球菌、奈瑟氏菌、梭桿菌屬和大腸桿菌科豐度增加,擬桿菌屬、梭菌目、糞桿菌屬、羅氏菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃球菌和毛螺菌科的豐度降低,CD患者發(fā)酵途徑減少,糖降解率升高,醌類生物合成增加形成了具有炎癥特征的微生物環(huán)境[10].

利用元轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn),在基因組學(xué)上豐富的物種更傾向于貢獻更多的轉(zhuǎn)錄途徑,揭示了腸道菌群的功能活性.IBD患者的魯米諾球菌豐度在RNA水平顯著增加,而在DNA水平僅輕度增加[11];哈氏梭菌、鮑氏梭菌豐度明顯增加,提示它們的作用比單一基因組學(xué)豐度的差異更明顯[12].

腸道菌群代謝產(chǎn)物對維持細胞正常的生理活動具有重要意義.其中,SCFAs又稱揮發(fā)性脂肪酸,是由1-6個碳原子組成的有機脂肪酸,主要由腸道中殘留的難以消化的膳食纖維在腸腔中經(jīng)厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生,大多由膳食纖維在結(jié)腸腔內(nèi)經(jīng)細菌酵解生成,也有少量來自于膳食蛋白和內(nèi)源性蛋白.短鏈脂肪酸種類多、功能復(fù)雜,引起廣泛關(guān)注.乙酸、丙酸和丁酸是腸內(nèi)主要的短鏈脂肪酸,約占所有SCFAs的95%以上,其在腸道中的摩爾比為60:60:20,在腸腔中達到峰值濃度(50 mM-100 mM)[13-15].據(jù)估計,近端結(jié)腸總量約70 mM-140 mM,遠端結(jié)腸總量約20 mM-70 mM[16-18].如表1所示,它是 IECs重要的能量來源[19],可通過多種機制抵抗病原體感染和應(yīng)激損傷,包括誘導(dǎo)抗菌肽LL37的表達、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Tregs)的增殖分化、激活G蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)、GPR43和GPR109a以及激活NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)來抵御病原體感染及應(yīng)激損傷[20].代謝組學(xué)研究表明在IBD患者中,腸道菌群紊亂導(dǎo)致短鏈脂肪酸減少.IBD患者的丁酸和丙酸水平顯著下降,給予丁酸酯和丙酸酯可有效緩解IBD的相關(guān)癥狀,提示丁酸和丙酸在IBD的發(fā)生中具有一定的作用[21].臨床研究表明[22],使用丁酸灌腸后患者癥狀明顯改善,同時發(fā)現(xiàn)白細胞計數(shù)、紅細胞沉降率、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)以及白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平均顯著下降[23],這些結(jié)果進一步表明SCFAs產(chǎn)生菌或SCFAs自身通過影響腸道免疫反應(yīng)、基因表達、細胞增殖以及宿主代謝等作用于宿主細胞,引起腸道炎癥[16,24,25].尤其是產(chǎn)丁酸菌的減少引起丁酸濃度降低,導(dǎo)致異常免疫應(yīng)答,引起黏膜損傷,從而使黏膜下層發(fā)生非特異性炎癥反應(yīng).

表1 與SCFAs相關(guān)的腸道菌群在IBD中的變化與功能

IBD包括UC和CD兩種疾病,由于發(fā)病機制與表現(xiàn)的不同,SCFAs在其中具有不同的作用.就保護腸黏膜屏障方面,UC與CD結(jié)腸中粘液層均變薄,MUC2產(chǎn)生減少,丁酸可通過刺激MUC2[26]表達從而產(chǎn)生黏蛋白保護腸粘液屏障以及增強ITF[18]改善腸黏膜傷口愈合.而CD病人的發(fā)病因素還包括Paneth細胞功能的障礙以及腸道細胞抗菌能力減弱[27],NOD2是CD病人最顯著的遺傳風(fēng)險因素之一,它由Paneth細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和吸收性IEC表達,當α-防御素水平較低時,NOD2可能發(fā)生突變,導(dǎo)致抗菌功能受損[28].CD病人中,SCFAs還能增加緊密連接蛋白表達降低腸上皮通透性[29],通過GPCR激活NLRP6[30],促進腸杯狀細胞分泌粘液,促進腸道免疫,逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎.此外,SCFAs對UC和CD病人均具有促進腸黏膜通透性與維持水電解質(zhì)交換平衡的作用.就影響宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)方面,二者作用途徑類似.SCFAs作用于多種免疫細胞調(diào)控其分化、趨化、募集、增殖和凋亡等過程,同時減少白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子的產(chǎn)生,抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄與遷移;通過叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead winged transcription factor,Foxp3)乙?；皆黾?作用于GPR43來誘導(dǎo)Treg細胞增殖分化,促進粘蛋白(mucins,MUC)、抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)以及細胞因子的分泌,通過GPR41和GPR43激活NLRP3,促進IL-1β和白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)的分泌[31,32];通過HDAC抑制途徑使組蛋白乙?；?抑制NF-κB途徑;抑制γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)/STAT1信號通路,誘導(dǎo)T細胞凋亡[33].

目前,多項臨床研究證明,補充丁酸可以有效緩解IBD,主要應(yīng)用于輔助治療,而丁酸等SCFAs的作用機制還有待進一步明確.

2 短鏈脂肪酸在腸上皮細胞的吸收、代謝與供能

腸黏膜屏障是機體吸收養(yǎng)分的主力軍,能整合多種微生物信號抵御病原體的入侵,協(xié)調(diào)腸腔微生物和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用,維持宿主-微生物和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài),促進腸道菌群和宿主共生[1].腸黏膜屏障分為由上皮細胞層和黏膜層組成的物理屏障、由免疫細胞和腸黏膜分泌的抗體組成的免疫屏障和由腸道共生菌組成的生物屏障[43].任意一種屏障功能的缺陷均可能導(dǎo)致有害因子入侵,機體免疫系統(tǒng)過度活化,引發(fā)黏膜炎癥,而導(dǎo)致IBD.

SCFA在腸道中的吸收經(jīng)歷了一個復(fù)雜的過程,它多以SCFA-的形式存在,通過多種方式被腸道上皮細胞攝取(如表2),包括被動擴散、通過離子通道轉(zhuǎn)運(如圖1A)以及通過G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)介導(dǎo)(如圖1B和C)進行運輸[44].

表2 SCFAs在腸道上皮細胞的轉(zhuǎn)運

載體介導(dǎo)的途徑在SCFAs攝取的過程中發(fā)揮了重要的作用(如圖1A).SMCT1(SLC5A8)和SMCT2(SLC5A12)是Na+偶聯(lián)的載體,SCFAs--HCO3-相偶聯(lián)通過SMCT1介導(dǎo)帶電的轉(zhuǎn)運(Na+:SCFAs-=2:1),SMCT2介導(dǎo)電中性的轉(zhuǎn)運(Na+:SCFAs-=1:1),MCT1(SLC16A1)和MCT4(SLC16A3)是H+偶聯(lián)的載體,介導(dǎo)SCFA的電中性轉(zhuǎn)運(H+:SCFAs-=1:1)[47].SCFAs在細胞內(nèi)外都能調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)、維持腸黏膜屏障功能以及刺激黏膜生成.在細胞外,SCFAs主要通過結(jié)腸微絨毛膜上的受體發(fā)揮作用,在細胞內(nèi)則通過抑制組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)、產(chǎn)生能量并轉(zhuǎn)化為酮體參與細胞能量代謝[47].

腸道炎癥及促炎因子對MCT1的表達和功能具有調(diào)控作用[50].使用藥物誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腸炎,發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸上皮中MCT1基因及其蛋白表達量顯著下降,在IECs培養(yǎng)基中加入IFN-γ和TNF-α后,通過QT-PCR、免疫印跡和免疫組化證明MCT1的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低,丁酸的轉(zhuǎn)運能力降低[51],MCT1表達量下調(diào)與WNT/β-catenin通路活性降低有關(guān)[52],該通路通過氧化應(yīng)激調(diào)控炎癥.提示腸道炎癥中丁酸氧化不足是MCT1介導(dǎo)的丁酸攝取減少的結(jié)果.

特別值得關(guān)注的是SLC5A8,有研究表明丁酸鹽通過SLC5A8將腸道菌群、膳食纖維和黏膜免疫系統(tǒng)聯(lián)系起來[53,54].給野生型(wild type,WT)小鼠和Slc5a8-/-小鼠分別喂食最佳纖維攝入飲食(fiber-containing diet,FC-diet)和無纖維攝入飲食(fiber-free diet,FF diet),對于攝入FC飲食的小鼠的存活率、直腸出血和腹瀉等癥狀以及結(jié)腸炎的進展均無顯著差異.而對于攝入FF飲食的小鼠,普雷沃菌、薩特氏菌、丹毒絲菌的豐度較FC飲食的小鼠高,Slc5a8-/-小鼠的小腸和結(jié)腸出血嚴重、體溫低,其結(jié)腸固有層有輕度炎癥和免疫細胞浸潤,小鼠體內(nèi)粘液分解的艾克曼菌含量更高,這可能導(dǎo)致結(jié)腸粘液層變薄,患結(jié)腸炎風(fēng)險增高.此外,Slc5a8-/-小鼠在經(jīng)DSS治療后表現(xiàn)出急性發(fā)病.通過結(jié)腸上皮轉(zhuǎn)錄組的分析,在Slc5a8-/-小鼠中,有助于黏膜修復(fù)的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表達降低,而SCFAs作為能量底物,通過SLC5A8與HIF-1α結(jié)合,并增加其穩(wěn)定性[53,55].此外,Slc5a8-/-小鼠的預(yù)防結(jié)腸炎的Akt信號途徑活性降低,Tlr2表達受抑制,從而使黏液三葉因子(trefoil factor,ITF)中的Tff1和Tff3的表達下調(diào)[56],調(diào)節(jié)性免疫細胞被抑制從而誘發(fā)炎癥[57].綜上所述,SCFAs的轉(zhuǎn)運在IBD的發(fā)生和治療中發(fā)揮著重要的作用,對SCFAs的轉(zhuǎn)運通道的調(diào)控與腸黏膜的保護作用、腸上皮細胞的能量代謝作用以及維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)等均密切相關(guān).

3 SCFAs保護腸上皮細胞

眾所周知結(jié)腸上皮由多種細胞構(gòu)成,形成了一個精細的防護屏障.SCFAs進入腸上皮細胞后,能夠通過一系列的信號通路進入不同的細胞結(jié)構(gòu)中,其中最受關(guān)注的是線粒體和細胞核,通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達以及炎性因子的釋放,有助于促進腸上皮細胞的增殖,并保障其完整性.

3.1 SCFAs促進腸上皮細胞增殖 結(jié)腸上皮細胞群是一個動態(tài)的群體,從干細胞到最終分化的結(jié)腸細胞,保持著增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)之間的動態(tài)平衡,其中,有一些關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子在精準調(diào)控這一過程,其中腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFAs是這一過程中不可或缺的重要參與者.

研究發(fā)現(xiàn)[58],當結(jié)腸內(nèi)SCFAs減少,上皮細胞的增殖受抑制,給大鼠結(jié)腸分別灌注乙酸、丙酸、丁酸后,結(jié)腸上皮細胞的增殖明顯的改善,其中丁酸作用效果最強.通過體外培養(yǎng)[59,60],在Wistar大鼠的移植小腸上補充丁酸,10 d之后在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)丁酸處理腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度均顯著高于對照組,提示丁酸對腸黏膜有明顯的促生長作用.

SCFAs維持腸黏膜穩(wěn)定性的作用可能與AP-1信號通路激活機制有關(guān)[61].丙酸鹽和丁酸鹽均是AP-1途徑的有效激活劑,尤其丁酸鹽的激活效率更高,它們可以增強PMA誘導(dǎo)的c-fos和ERK1/2磷酸化表達,減弱細胞周期蛋白D1[62],降低與細胞增殖相關(guān)的其他基因水平,如cdk1以及誘導(dǎo)分化的特異性基因,包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ型.其中,ERK1/2主要與細胞生長、增殖和分化有關(guān),在HT-29和Caco-2細胞中[61],發(fā)現(xiàn)丁酸鹽單獨作用對ERK1/2磷酸化有輕微的影響,但是丁酸鹽與PKC激活劑PMA一同作用顯著地促進ERK1/2的磷酸化,提示丁酸鹽與PMA共同使用對AP-1途徑具有協(xié)同的作用.ERK1/2的過度誘導(dǎo)有助于激活c-fos,該基因也被認為是ERK1/2激活持續(xù)時間的“傳感器”[63].因此,SCFAs不僅能夠作為腸上皮細胞的主要能量來源,還能夠促進上皮細胞增殖、分化,減少細胞凋亡,對維持腸黏膜上皮細胞的穩(wěn)定性具有重要意義[64].

3.2 SCFAs保護腸黏膜屏障的完整性 腸道黏膜屏障在宏觀和微觀上的完整性在維持腸道穩(wěn)態(tài)中具有重要的意義,SCFAs可以通過調(diào)節(jié)炎性因子的釋放以及腸上皮細胞的自噬等來維持腸黏膜的完整性.

SCFAs與腸上皮細胞GPR43受體結(jié)合,刺激K+的流動,使腸上皮細胞膜超極化,通過調(diào)節(jié)活性氧的生成激活NLRP3炎性小體[65],促進IL-1的分泌,并且通過激活Caspase 1,增加pro-IL-18的表達[66],促進IL-18的產(chǎn)生,保持腸上皮細胞的完整性[67].在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸上皮細胞顯示[67],在高膳食纖維喂養(yǎng)或經(jīng)醋酸鹽處理后的WT小鼠血清中IL-18水平遠高于Gpr43-/-和Gpr109a-/-小鼠,同時Gpr43-/-小鼠和Gpr109a-/-小鼠未能表現(xiàn)出體重增加、結(jié)腸長度的改善或是結(jié)腸組織損傷的減少,說明GPR43和GPR109a參與到了IL-18分泌的過程中,并改善IBD.體內(nèi)IL-18的釋放與一些腸道菌群相關(guān),通過Pearson相關(guān)性,丁酸產(chǎn)生菌Lachnospiraceae[68]、乙酸和丙酸產(chǎn)生菌Rikinellaceae和Porphyromonadaceae[69]與SCFAs相關(guān),且與Myd88[70]、Irak[71]、TLR5[72]和TLR4[73]有關(guān),提示可能參與TLR信號通路.

除此之外,特別值得關(guān)注的是GPR43是SCFAs在中性粒細胞上的唯一受體,參與炎性因子的釋放以及調(diào)節(jié)O-的產(chǎn)生和吞噬作用.中性粒細胞聚集可使腸黏膜屏障受損,加重IBD的癥狀.在大鼠體外模型中[74],發(fā)現(xiàn)SCFAs可增加中性粒細胞地遷徙和黏附,還能提高中性粒細胞表面L-selectin mRNA的水平與表達,SCFAs是通過GPR43參與中性粒細胞的趨化反應(yīng)中與穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),實現(xiàn)機體的自我保護機制.

多個自噬相關(guān)基因及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與IBD有關(guān),有研究證實IBD患者腸上皮細胞缺乏自噬使腸上皮細胞正常的生理平衡破壞.CD的風(fēng)險位點ATG16L1[75]突變,表現(xiàn)出位于小腸隱窩底部的Paneth細胞自噬功能受損,影響細胞內(nèi)物質(zhì)和細胞器的降解與循環(huán),減少抗菌物質(zhì)的分泌以抵抗感染和清除胞內(nèi)微生物[76,77],該缺陷被證明與患有CD風(fēng)險增加有關(guān),還會使DCs向T細胞呈遞外源性抗原能力降低[78].此外,在全腸外營養(yǎng)大鼠模型中[79],無菌小鼠的腸上皮出現(xiàn)了自噬現(xiàn)象,當在補充丁酸鹽后腸上皮恢復(fù)了完整性,提示可能大鼠結(jié)腸細胞中丁酸代謝受抑制,導(dǎo)致β-氧化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化關(guān)鍵酶減少,ATP的合成受阻,AMPA激活,p27kip1磷酸化,最終導(dǎo)致腸道自噬.

微循環(huán)缺氧也是IBD的一個重要特征,在IBD患者腸道固有層和缺氧的腸腔中間,發(fā)現(xiàn)了“生理性缺氧”環(huán)境,該環(huán)境可誘導(dǎo)腸上皮細胞自噬以及抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(mammalian target of rapamycin/NOD-like receptor protein 3,mTOR/NLRP3)途徑來調(diào)節(jié)機體炎癥[80].其中,HIF-1α是維持氧穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄激活因子[81],HIF-1α的上調(diào)可以抑制NF-κB信號通路發(fā)揮保護作用,減少細胞炎癥,還能夠影響腸道菌群的平衡,在維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)中起到了核心作用(如圖2所示).丁酸通過誘導(dǎo)結(jié)腸細胞乏氧性代謝,增強胃腸道中HIF-1α的穩(wěn)定性.通過FITC葡聚糖通量測量得出,丁酸鹽可以促進T84細胞的屏障功能,而缺乏HIF-1α?xí)r可導(dǎo)致屏障功能受損.結(jié)果進一步提示,丁酸鹽通過HIF-1α調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能[55].同時研究證明丁酸鹽進入線粒體后,作為HDAC抑制劑刺激丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)基因啟動子,促進PDK基因表達,使丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDHC)活性降低[82],因此結(jié)腸細胞不能通過β-氧化將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA,抑制了氧化呼吸,導(dǎo)致生理性缺氧[55],該過程有利于維持HIF-1α的穩(wěn)定性.HIF-1α可促進粘蛋白(mucins,MUC)分泌,使MUC2、MUC3[83]和ITF[84]上調(diào),粘液層的厚度增加,為腸道微生物定植提供了空間.

環(huán)境缺氧能夠降低CD患者結(jié)腸中的TNFα、Il-6和NLRP3的表達,誘導(dǎo)p62mRNA的表達和p62蛋白的減少,提示可能有自噬基因的翻轉(zhuǎn)[80].有研究進一步證明HIF-1α和NF-κB參與調(diào)節(jié)黏膜缺氧反應(yīng)在多個水平上密切相關(guān).在低氧條件下,HT-29的細胞中HIF-1α與p62啟動子結(jié)合增加,提示HIF-1α參與了自噬蛋白的表達;NF-κB參與了與NLRP3的啟動子結(jié)合.這兩種機制表明兩個核因子的調(diào)控相反,與其拮抗功能一致[80].HIF-1α的穩(wěn)定性增加可以抑制NF-κB,從而抑制促炎癥反應(yīng).siRNA沉默HIF-1α后,發(fā)現(xiàn)Hela細胞IL-1β 和TNF-α等細胞因子誘導(dǎo)NF-κB產(chǎn)生,其活性顯著增加[55].并伴隨有NF-κB的特征性靶點p100和IL-8水平增加.同時,可見NF-κB靶基因A20、Cyld、DDX3、IAP1和XIAP的mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,雖然HIF-1α對NF-κB的抑制得到公認,但是,最新研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α的過表達可降低對NF-κB抑制效應(yīng),推測該作用可能與機體的負反饋有關(guān).綜上所述,SCFAs通過調(diào)節(jié)腸道細胞的增殖與代謝相關(guān)蛋白的表達來影響腸道黏膜的完整性.

4 SCFAs保護腸道黏液屏障

腸道黏液屏障在腸道中起著潤滑和物理屏障的雙重作用,是腸道的第一道防線,主要由腸道Paneth細胞分泌的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)和杯狀細胞分泌的MUC和ITF組成,此外,還有免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、活性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)等.黏液除有潤滑作用,還可減少酸和蛋白酶對腸道黏膜的侵蝕作用,同時也為腸道微生物提供適宜的生活環(huán)境.

不可否認SCFAs在腸道化學(xué)屏障的保護中具有重要的作用.AMP由IECs和Paneth細胞產(chǎn)生,能夠抵御微生物群和病原體,AMP的不同家族包括防御素、殺微生物肽和C-型凝集素(如REG家族)[85].GPR43-/-的小鼠較WT小鼠腸上皮細胞的RegⅢγ和β-defensin 1、3、4表達水平均下降[86],口服SCFAs后,WT小鼠的RegⅢγ和β-防御素明顯上升,而GPR43-/-的小鼠無變化,提示SCFAs通過GPR43依賴的方式促進腸上皮細胞生成AMP.此外,SCFAs能夠激活mTOR和STAT3,用siRNA特異性敲除mTOR、用 siRNA特異性敲除STAT3并分別轉(zhuǎn)染MSIE細胞[86],RegⅢγ和β-防御素的蛋白表達量均明顯降低,說明丁酸可能通過激活mTOR和STAT3來調(diào)節(jié)AMP的產(chǎn)生.因而,SCFAs調(diào)節(jié)AMP產(chǎn)生具有GPR43依賴性,并且mTOR和STAT3對該途徑具有一定的協(xié)同作用.

SCFAs在腸道物理屏障中作為調(diào)節(jié)器也發(fā)揮著不容小覷的作用,SCFAs可通過GPR43受體,促進腸上皮細胞分泌IL-18、抗菌肽、MUC,維持腸屏障的完整性.MUC的產(chǎn)生與muc基因有關(guān),其中,muc1、muc3、muc4編碼膜上的MUC,MUC2主要與腸道中分泌性MUC有關(guān)[87].MUC2是最受關(guān)注的一種黏蛋白,其改變與多種腸道疾病相關(guān),它的寡聚糖鏈結(jié)構(gòu)能為腸道菌群中的益生菌、IgA以及抗菌肽提供黏附位點,協(xié)助其定植,用以發(fā)揮生物屏障和免疫屏障的作用[88].有研究證實丁酸鹽通過介導(dǎo)MUC2啟動子處的AP-1和乙?；?甲基化(acetylation/methylation),同時也參與MUC表達的調(diào)控中[89].使用丁酸鹽和丙酸鹽可誘導(dǎo)LS174T細胞MUC2 mRNA水平升高,該作用通過MUC2啟動子內(nèi)-947/-371處丁酸反應(yīng)區(qū),在這個區(qū)域中的-818/-808處發(fā)現(xiàn)了一個活性的AP1(c-Fos/c-Jun)順式元件,介導(dǎo)丁酸誘導(dǎo)的啟動子激活,同時發(fā)現(xiàn)丁酸鹽對MUC2的調(diào)節(jié)與組蛋白H3和H4的乙?；黾右约癕UC2啟動子H3的甲基化有關(guān).至此可見,丁酸對MUC2的產(chǎn)生與MUC2基因的轉(zhuǎn)錄與表達具有一定的調(diào)控作用.在一項系統(tǒng)性研究中發(fā)現(xiàn)[90],UC患者MUC2結(jié)構(gòu)或合成的改變對結(jié)腸黏膜完整性有影響,因而進一步的探索維持黏膜完整性是極其必要的.

腸黏液屏障是一個十分復(fù)雜的體系,SCFAs在IBD中的調(diào)節(jié)機制尚不明確,但不可否認的是,腸道黏液在IBD的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,而SCFAs在腸道黏液的調(diào)節(jié)中也是重要的一環(huán).在未來的研究中,機制的完善或可以為IBD疾病的治療提供新的靶點.

5 SCFAs加強腸道上皮細胞間的緊密連接

IECs依靠細胞旁路中的“看門人”維持上皮細胞的穩(wěn)定性與組織間的穩(wěn)態(tài),這些“看門人”就是細胞間的粘附,包括緊密連接(tight junction,TJ)、黏附連接和橋粒[91].TJ和腸道粘液層是維持腸道完整的重要結(jié)構(gòu).其中,TJ位于相鄰細胞之間,呈帶狀環(huán)繞細胞的頂部,由緊密連接蛋白Claudins、Occludins和封閉小帶(zonula occludens,ZO)形成,可以在相鄰細胞之間形成一道閉鎖屏障,防止大分子物質(zhì)進入,是機體防御病原體的重要機制.

5.1 SCFAs作用于緊密連接蛋白 TJ在控制細胞旁的通透性方面具有核心作用,TJ蛋白Claudins是一種具有高容量和選擇性的通道,其中,Claudin-2對小的陽離子和水具有一定的滲透性,因此,Claudin-2導(dǎo)致的腸黏膜屏障損壞的患者可能會腹瀉[92,93];ZO-1和occludin則與之相反,它們是一種低容量,非選擇性的,只限制通過該通道的分子大小[94].SCFAs對緊密連接及其蛋白具有重要的調(diào)控意義,但是目前,SCFAs對于緊密連接蛋白的調(diào)控機制并未被完全闡明.

S C FA s能夠修復(fù)屏障障礙,以T J為其作用靶點,比如Claudin-2是丁酸作用的主要靶點.有研究證實在Caco-2細胞中TNF-α、IFN-γ和白細胞介素13(interleukin-13,IL-13)添加到基底膜外側(cè),SCFAs添加至頂膜,作用24 h后[95],結(jié)果顯示丁酸可以改善TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的TER降低,并抑制TNF-α和IFN-γ介導(dǎo)的Claudin-2水平升高和Claudin-3水平降低,此外,丁酸鹽還抑制了IL-13介導(dǎo)的TER降低和Claudin-2水平的升高,提示TNF-α/IFN-γ和丁酸均可以參與調(diào)節(jié)與腸黏膜屏障功能相關(guān)的AMP-活化蛋白激酶.TNF-α[96]和IL-13[97]通過PI3K通路使Claudin-2水平升高,該途徑可以被丁酸抑制[98].PI3K通路還可以激活與細胞存活相關(guān)的Akt通路[99].由此,丁酸通過提高Claudin-2的含量以減輕腸屏障功能的障礙,有助于為腸黏膜屏障損壞相關(guān)疾病的治療提供幫助.

突觸足蛋白(synaptopodin,SYNPO)是另一種通過抑制HDAC受丁酸調(diào)控的腸上皮緊密連接蛋白,具有調(diào)節(jié)屏障功能和促進愈合的潛力[100].在T84細胞中發(fā)現(xiàn)SYNPO與ZO-1共定位于腸上皮細胞緊密連接處;SYNPO的抗體的定位具有非特異性,分布于非緊密連接的區(qū)域;應(yīng)用phalloidin染色顯示,用5 mM丁酸后與肌動蛋白彈力纖維相關(guān)的SYNPO的水平顯著高于對照組[100].SYNPO通過調(diào)節(jié)肌動蛋白絲組裝、應(yīng)力纖維形成并維持細胞間相互作用參與腸上皮屏障功能[101].

有研究表明在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎時[100],SYNPO的蛋白表達量顯著降低,并且結(jié)腸組織有炎性浸潤和上皮隱窩損傷,而ZO-1的蛋白水平并無改變.但是TNF-α、IL-1β、INF-γ處理后的T84細胞中[100],可見SYNPOmRNA在中的表達降低.這些實驗結(jié)果均說明了炎癥對SYNPO的表達具有不利的影響.

與此同時,有研究證實丁酸鹽通過抑制HDAC調(diào)節(jié)SYNPO,其對上皮修復(fù)功能通過肌動蛋白與SYNPO的偶聯(lián)調(diào)控,而SYNPO是關(guān)鍵的微生物調(diào)節(jié)蛋白,它能夠?qū)⒓拥鞍锥ㄎ挥诰o密連接處,并形成一個動態(tài)的收縮以及信息交流中樞部位.SYNPO調(diào)節(jié)α-輔肌動蛋白4(α-actinin-4,ACTN4)的表達[102],并促進它在黏附連接處的累積,參與到細胞收縮的功能中,同時,丁酸可誘導(dǎo)ACTN4的表達[100].在T84細胞中,丁酸鹽可以增加F-actin與總肌動蛋白的比值,但是,SYNPO-/-細胞中該比值沒有增加.因此,丁酸需要肌動蛋白與SYNPO的偶聯(lián)參與到上皮細胞傷口的愈合中.隨著研究的深入,將發(fā)現(xiàn)更多緊密連接蛋白靶點,探索其作用機制,以期為IBD的治療提供參考和理論基礎(chǔ).

5.2 SCFAs促進緊密連接的重組[103]在IBD患者的腸黏膜可見緊密連接的失調(diào)以及上皮細胞損傷.實驗研究表明SCFAs可緩解小鼠結(jié)腸炎病理變化,其主要機制SCFAs通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate -activated protein kinase,AMPK),抑制(myosin light chain kinase/myosin light chain 2,MLCK/MLC2)通路,并介導(dǎo)(protein Kinase Cβ,PKCβ)磷酸化,使ZO-1、Occludin、Claudin-3和Claudin-4等腸上皮細胞連接蛋白的表達上調(diào),促進緊密連接的形成[103].給予AMPK激動劑的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎較對照小鼠有明顯改善,結(jié)腸組織中的炎性因子IL-18,IL-1β,COX-2,iNOS和IL-6的mRNA水平下降.腸組織發(fā)生損傷后,腸上皮緊密連接蛋白Claudin-1,Occludin和ZO-1的表達水平下降,腸上皮通透性增加,AMPK激動劑可以逆轉(zhuǎn)這一變化[104].發(fā)現(xiàn)在活動性IBD患者中,MLC磷酸化水平顯著增加,MLCK酶活性增加.使用Caco-2細胞模型,發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平升高可以導(dǎo)致Connexin43(Cx43)蛋白在絲氨酸368位發(fā)生磷酸化,Cx43與膜蛋白ZO-1結(jié)合降低并進入胞漿,使細胞膜上的ZO-1形成更為穩(wěn)定的緊密連接,改善了腸上皮結(jié)構(gòu)和功能.Miao等人發(fā)現(xiàn)[105],丁酸鈉通過調(diào)節(jié)鈣池誘導(dǎo)細胞外Ca2+內(nèi)流(store-operated calcium entry,SOCE),激活Ca2+/CaMKKβ途徑,從而激活A(yù)MPK.丁酸鈉對緊密連接的重構(gòu)通過MLCK/MLC2途徑,其中丁酸鈉可促進MLC2在Ser19處的磷酸化水平降低、PKCβ2的Ser660處或PKCβ1的Thr642處的磷酸化水平增加的過程(詳細過程見圖3).

以上結(jié)果表明,丁酸鈉可介導(dǎo)A M P K磷酸化,進而抑制M L C2的磷酸化,促進P K C β2的磷酸化,p-Cx43(Ser368)水平升高,促進ZO-1形成緊密連接(如圖3),并使結(jié)腸組織中的炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),有利于Caco-2細胞中緊密連接的重組,有助于改善IBD.該機制也為IBD的治療提供新的靶點和候選藥物.

6 SCFAs影響腸黏膜屏障的通透性和水電解質(zhì)的吸收

在對有CD家族史的家族進行隊列分析,研究家族成員腸道通透性早期發(fā)病特征可能包括腸道通透性增加[6].腸上皮細胞具有高選擇性的屏障的特點,這有助于小分子等營養(yǎng)物質(zhì)從腸腔進入到黏膜下層.在Caco-2和HT-29細胞中,2 mmol/L丁酸誘導(dǎo)TER增高且通透性降低,而8 mmol/L的丁酸誘導(dǎo)通透性增加,Caco-2活細胞數(shù)量減少,表明丁酸調(diào)節(jié)腸上皮通透性與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)[58].不僅如此,TJ也會影響腸黏膜屏障的通透性.多個研究表明[106,107],在SCFAs參與到了水電解質(zhì)的調(diào)節(jié)中,SCFAs的灌注家兔近端結(jié)腸顯著減少結(jié)腸中水分的分泌,作用程度為: 丁酸＞丙酸＞乙酸.丁酸鹽顯著減少了Na+、Cl-和K+的分泌,但對HCO3-沒有影響.SCFAs還可通過調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細胞內(nèi)cAMP促進Na+的吸收[58,108].

7 總結(jié)

綜上所述,SCFAs是腸道微生物代謝產(chǎn)物,亦是腸道健康的守護者.尤其是丁酸鹽,作為腸道菌群和腸道黏膜屏障之間的橋梁受到廣泛關(guān)注.SCFAs通過多種機制調(diào)節(jié)黏膜屏障作用,重構(gòu)黏膜屏障,緩解IBD癥狀.目前,一些新型的生物制劑和小分子藥物也在IBD的治療中展現(xiàn)出了一定的潛力,醫(yī)生對IBD的治療也逐漸趨向于個體化,即將迎來更多的選擇與挑戰(zhàn).對SCFAs的深入研究或可成為治療相關(guān)疾病的一個研究方向.