張 璐，何慧芬，秦愛建,2，錢 琨,2,3*

(1.揚州大學 教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室/江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3.揚州大學比較醫(yī)學研究院，江蘇揚州 225009)

接種疫苗是預防和控制畜禽疫病發(fā)生與傳播的最具成本效益的干預措施，也是獸醫(yī)學中使用最廣泛的工具。自人類歷史上的第一代疫苗的發(fā)明到今天，疫苗的研發(fā)已經(jīng)歷了數(shù)百年時間，經(jīng)過不斷地研發(fā)和改進，目前研發(fā)成功的疫苗主要有以下幾種類型[1-2]：①傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗：主要為滅活或減毒病原體或利用清除病原體的亞基如毒素、多糖或蛋白質(zhì)等制成的一類疫苗；②基因工程疫苗：是利用基因工程技術或化學技術合成的一類疫苗，主要包括亞單位疫苗、合成肽疫苗、病毒或細菌活載體疫苗等；③核酸疫苗：是利用基因工程技術將編碼某種抗原的外源基因直接導入動物機體內(nèi)表達，誘導機體產(chǎn)生免疫應答的一類疫苗。隨著對各種病原微生物的深入了解及生物技術的高速發(fā)展，基因工程疫苗的開發(fā)是新型疫苗的主要方向，其中重組活載體疫苗成為研究的熱點。

1 畜禽皰疹病毒活載體疫苗概述

自1984年將痘病毒開發(fā)為疫苗載體以來，已經(jīng)探索了多種病毒在活載體疫苗中的應用。目前全球市場中可見的至少有12種病毒載體疫苗已獲準用于獸醫(yī)領域[3]，如新城疫病毒(La Sota株)、禽痘病毒、火雞皰疹病毒等。皰疹病毒是一類有囊膜的雙鏈DNA病毒，基因組中普遍存在病毒復制非必需的基因，這為外源基因的插入提供了得天獨厚的位點，可以攜帶多個相同或不同病原的抗原基因，用于制備多價苗或者多聯(lián)苗。皰疹病毒還具有感染廣泛宿主細胞和誘導或分散免疫反應的潛力，利用皰疹病毒構建的活載體疫苗可誘導特異性黏膜免疫，在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，達到一次接種，終生免疫的效果。但也存在一定的缺陷，比如在病毒載體上只能插入引起完全保護性免疫反應的抗原，且外源基因在病毒載體中表達還可能改變其組織嗜性。目前已有多種皰疹病毒用于活載體疫苗的研發(fā)，如偽狂犬病毒、家禽皰疹病毒、牛皰疹病毒等。其中梅里亞公司生產(chǎn)的明星產(chǎn)品威力克(HVT-VP2)疫苗是一種將傳染性法氏囊病病毒中的VP2基因插入到火雞皰疹病毒中構建而成的活載體疫苗，能有效保護傳染性法氏囊病毒和馬立克氏病病毒的攻擊[4]，廣泛應用于生產(chǎn)實際。

2 畜禽皰疹病毒活載體疫苗構建的主要技術方法

2.1 同源重組

同源重組是普遍存在于自然界中的生物學現(xiàn)象，可以雙向交換DNA分子，也可以單向轉(zhuǎn)移DNA分子。研究者們根據(jù)同源重組原理，實現(xiàn)對宿主DNA的缺失、插入和置換突變。利用同源重組法構建重組疫苗的過程相對簡單,可以省去很多的時間和精力，是目前使用最多的方法。如用偽狂犬病病毒同源重組豬細小病毒VP2基因[5]。但同源重組效率低,不容易篩選。為了解決這一難題，科學家們做了多方面嘗試。①選擇合適的病毒活載體。即在插入外源基因后不影響親本病毒的復制增殖，其次是要具有一些復制非必需區(qū)或基因間隔序列為外源基因的插入提供靶點；②同源臂的長度。研究表明，同源臂過長或過短均會影響外源基因的重組效率，一般大于1 kb；③外源基因表達盒的長度。表達盒過長不容易整合到病毒載體中；④選擇恰當?shù)闹亟M病毒篩選方法，可一定程度上相對提高重組效率。隨著分子生物技術的發(fā)展，研究者們在傳統(tǒng)同源重組技術的基礎上建立了更加簡單、快速、高效同源重組技術，即Red/ET、Cre/loxp和FLP/FRT重組技術。這些重組系統(tǒng)高效簡單，不需要任何其他分子的參與，通常與細菌人工染色體、 CRISPR/Cas9基因編輯技術等聯(lián)合使用。

2.2 細菌人工染色體

細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)是一種以F質(zhì)粒為基礎構建而成的細菌染色體克隆載體。由于BAC的復制速度特別慢，對于皰疹病毒而言，構建BAC重組毒相對容易和準確，在適宜條件下能快速產(chǎn)生新病毒，并且能夠穩(wěn)定遺傳。有研究把鼠巨細胞病毒(Mouse cytomegalovirus, MCMV)整個基因組克隆為感染性BAC,這一技術在多種皰疹病毒中獲得成功[6]。但是BAC的構建過程較復雜、周期長，當克隆較大基因組時，基因組易在操作中發(fā)生斷裂而影響病毒拯救，并且可能在病毒基因組中殘留一些細菌基因組序列，不符合疫苗生產(chǎn)的生物安全要求，因此在利用BAC系統(tǒng)研發(fā)重組疫苗時，還需進一步考慮敲除殘留序列。

2.3 黏粒

黏粒是指一類含有λ噬菌體的cos序列的質(zhì)粒載體，已有大量不同的黏粒載體用于克隆病毒以及細菌的基因組。該方法操作簡便、構建周期短并易于進行改造。但黏粒系統(tǒng)的容量有限，對于一些較大的基因簇需要分段克隆，兩個黏粒之間如果存在同源序列會發(fā)生重組，導致DNA序列的重排或丟失，且含不同重組DNA的菌落生長速度不一，會出現(xiàn)外源DNA的比例失調(diào)，包裝效率不穩(wěn)定等現(xiàn)象。針對此問題有人開發(fā)了一種新型黏粒即Fosmid，該載體系統(tǒng)穩(wěn)定性好、無偏向性、拷貝數(shù)可誘導、構建周期短以及操作簡便，最近幾年被廣泛用于基因文庫構建[7]。

2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術

CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，是結(jié)構最簡單的系統(tǒng)，能高效地介導基因定點敲入或敲除,同時沉默任意數(shù)量基因[8]。CRISRP/Cas9基因編輯技術主要分為兩個過程。首先，Cas9蛋白特異性切割目標DNA序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂；其次，在DNA修復系統(tǒng)的修復過程中實現(xiàn)DNA序列的改變。根據(jù)這一原理人工設計sgRNA(guide RNA)來識別目的基因組序列，并引導Cas9蛋白酶進行有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂，人工提供修復模板后可達到將外源基因敲入病毒基因組的目的。CRISPR/Cas9相比其他方法具有構建方便、簡單快捷及性價比高等優(yōu)點[9]。但同時也存在諸多問題，首先是存在較高的脫靶概率，其次是導入目的基因后存在Cas9酶的殘留，目前還沒有有效的手段在Cas9-sgRNA奏效后去除Cas9。除此之外，CRISPR修飾位點受到PAM序列和sgRNA的限制，近期還有研究表明應用CRISPR/Cas9基因編輯還可能會導致基因突變。

3 畜禽皰疹病毒重組基因工程疫苗的研發(fā)

3.1 偽狂犬病病毒載體

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因組約143 kb,各基因的功能基本確定。研究表明，PRV部分基因的缺失或替換不影響病毒的復制與傳播，用豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的囊膜糖蛋白E1來取代PRV基因組中非必需糖蛋白gX，構建1株有效的PRV減毒活疫苗。此后大量的PRV基因缺失苗被成功研制，其中Bartha K61和PRV SA215已被商業(yè)化使用。由于這些疫苗安全有效，可用做重組疫苗的載體，目前已經(jīng)確定了PRV基因組中幾個常用的基因插入位點，如TK、gI、gE、PK和gG 基因等。常見的重組外源病毒包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬流感病毒、日本腦炎病毒、口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒及非洲豬瘟病毒等。此外，還有某些寄生蟲如弓形蟲、血吸蟲等保護性抗原在PRV中也有所表達。

研究發(fā)現(xiàn)，在PRV基因組中不同位點插入相同抗原構建的重組病毒的免疫保護效力有所不同。如在gI/gE、gG/gD位點插入豬瘟病毒(CSFV)E2蛋白，高滴度免疫可使豬完全免受CFSV的攻擊[10]，而在US9位置插入CSFV E2蛋白，未能誘導產(chǎn)生針對E2蛋白的抗體[11]。此外，在PRV基因組中相同位點插入不同抗原構建的重組病毒其免疫保護效果也有所不同。如在gG位置插入豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2能誘導產(chǎn)生針對PCV2的中和抗體，而插入Cap蛋白，卻未能檢測到針對Cap的抗體。由此可以得出，重組病毒的免疫保護效果或許與外源基因和插入位點有關。此外，還有研究表明共表達細胞因子和保護性抗原能增強重組病毒的免疫保護效果[12]。除了在常見位點TK、gI、gE、PK和gG等插入外源基因能夠產(chǎn)生較好的免疫保護效果外，在UL40/41的非編碼區(qū)插入豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S基因構建的重組PRV，免疫斷奶仔豬也能誘導產(chǎn)生低水平的抗體[13]。這為PRV活載體疫苗的構建提供了新的技術支持。目前，大多數(shù)表達外源基因的重組PRV都是同源重組的方式構建，這可能與同源重組技術構建簡單方便且技術成熟等因素有關。相反，CRISPR/Cas9這種新興的能高效介導基因定點敲入的方法應用較少，直到2018年非洲豬瘟迅速席卷全國，急需研制有效疫苗預防和控制該病的發(fā)生與傳播，用CRISPR/Cas9構建表達ASFV CD2v蛋白的重組PRV，免疫后誘導小鼠產(chǎn)生抗CD2v特異性抗體和細胞免疫反應，100%保護小鼠免受毒株PRV-Fa的攻擊[14]。這為CRISPR/Cas9技術在PRV重組病毒中的應用奠定了基礎，也為非洲豬瘟的防控提供了技術支持，在今后的研究中用CRISPR/Cas9技術同時插入多個外源基因可能會成為PRV重組病毒研究的主要趨勢。

近年來大多重組PRV都能誘導產(chǎn)生相應的特異性抗體或細胞免疫反應，甚至部分重組病毒對強毒的攻擊有完全保護作用，但這些重組病毒未得到商業(yè)化應用。分析原因可能包括以下幾個方面[15]：①需優(yōu)化病毒感染和復制，以生產(chǎn)高效、安全的疫苗，此項工作復雜繁瑣。②需要對重組PRV構建中摻入的一些非必要基因進行敲除，從而使其更適合臨床應用。③將現(xiàn)有疫苗轉(zhuǎn)換為重組疫苗的周期較長，需制定長期計劃。④由于臨床試驗成本過高，導致許多對于重組PRV 的研究尚未推進到自然宿主豬中，無法預測評估一些實際問題。

3.2 馬立克氏病病毒載體

馬立克氏病是由馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的家禽免疫抑制及腫瘤性疫病。目前MDV也是唯一能用疫苗預防的腫瘤性疾病。其中MDV-1型中的CVI988/Rispens 株和火雞皰疹病毒(Herpes turkey virus,HVT)是目前應用最廣泛的疫苗株。由于MDV是細胞結(jié)合型病毒，主要在細胞間傳播，能很好的抗母源抗體的干擾，故自1988年起研究人員便開始研發(fā)重組MDV疫苗。近年大部分禽類的常見病原體的保護性抗原在HVT中均有表達[16]，成功構建了HVT二價苗,此外還有同時插入兩個不同外源基因的三價HVT也被成功構建，具有一定的免疫保護效果[17]。

目前，在HVT中外源基因的插入位點多集中在UL45/46,例如在此位點構建多種表達不同亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA基因的重組疫苗，包括H7N1、H9N2，其免疫保護效果不盡相同。而在US2位點構建的AIV(H5)-重組HVT具有針對抗原漂移的H5Nx病毒提供交叉保護和阻止排毒的潛力[18]。以HVT為載體表達新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因的重組病毒在1992年被首次構建，對于NDV的攻擊具有部分保護作用。在之后研究中，將NDV F或HN基因插入HVT的不同位點構建的重組病毒均有完全保護作用。研究發(fā)現(xiàn)表達Ⅰ型NDV F及Ⅵ型NDV F和HN的重組HVT可提供針對Ⅶ[19]型和Ⅳ型交叉臨床保護[20]。表達傳染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus,IBDV) VP2蛋白的重組HVT，即威力克疫苗，能對致命IBDV攻擊提供完整持久的保護，被廣泛應用于生產(chǎn)實際。此外，同時表達IBDV VP2和NDV F的重組HVT被成功構建，也得到了商品化應用[21]。而在相同位點表達其他病原的雙價或多價重組HVT雖有較好的保護效果，但未得到商品化應用，這可能與表達的外源基因不同有關。

隨著MDV強毒株的出現(xiàn)，HVT的保護效果受到了限制，相繼的以MDV-1型CVI988/Rispens株、814株以及一些Meq缺失株為載體的重組MDV被成功構建[22]。與HVT不同的是，MDV-1型毒株中外源基因的插入位點和構建方法較為單一，CVI988/Rispens株插入位點主要集中于IRS-US連接區(qū)和sorf1/sorf2，均由同源重組方法構建；814株中的插入位點主要集中在US2位點，主要通過Fosmid構建；Meq缺失株的插入位點幾乎都在Meq區(qū)，主要通過BAC構建。對這些重組疫苗的免疫保護效力進行評價，結(jié)果顯示大部分重組病毒有一定的保護作用。

3.3 傳染性喉氣管炎病毒載體

傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)中的gG、gJ、gM 和 gN是病毒的復制非必需基因，許多基因缺失的重組ILTV被成功構建，如缺失UL47、gC、ORF C、TK、UL10和UL49.5、UL50以及UL0，免疫雞后都提供了一定的保護作用。近年來構建了多種表達高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同亞型的HA和NA基因的ILTV重組病毒。H5的HA/N1基因插入UL50基因位點,H7亞型的HA基因插入UL0位點。這些重組ILTV對ILTV和AIV均有一定的保護作用，其中ILTV-DeltaUL50IH5V能夠保護雞免受 H5亞型的不同 HPAIV分離株的侵害[23]。以同源重組或CRISPR/Cas9等方法分別構建了3種表達基因Ⅶ型 NDV F蛋白的重組病毒[24-25]。3種重組病毒保護效果較好，有望成為二價疫苗候選株。

3.4 鴨腸炎病毒載體

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV) 的TK、US1、US10和US2等區(qū)域為DEV復制非必需區(qū)[26]。目前可供插入的位點主要有TK、UL27/26、UL44、US7/8、gE等。已有研究報道了表達禽流感病毒、小鵝瘟病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎病毒及鴨坦布蘇病毒等病毒保護性抗原的重組DEV被成功構建，大部分重組病毒免疫動物后有一定的免疫保護效果，少數(shù)重組病毒未進行免疫保護效力評價。在DEV基因組不同位點表達AIV不同亞型HA基因的重組病毒，均有較好的免疫保護效果。例如，在DEV疫苗株的US7和US8基因之間插入禽流感病毒H5N1 AIV的HA基因得到的重組毒，能快速且穩(wěn)定的的產(chǎn)生針對于H5N1 AIV的保護作用，并且在之后的研究中還發(fā)現(xiàn)rDEV-us78HA對異源 H5N6和 H5N8 AIV也有保護作用[27]。在gI、gE、US2位點表達鵝源H5N1 AIV HA的重組DEV免疫鴨后產(chǎn)生抗 DEV和AIV特異性抗體，能抵抗 DEV病毒的感染[28]。然而在US7-US8基因之間表達的NDV La Sota 株F蛋白和HN蛋白，只有rDEV-F對NDV F48E9株感染有100% 的保護作用，而rDEV-HN無免疫保護作用。這表明重組疫苗的免疫保護效力可能與插入的外源基因有關。

3.5 牛皰疹病毒1型載體

以牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)為載體的重組病毒研究主要集中在口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)和偽狂犬病病毒(PRV)。目前已有多篇報道利用牛皰疹病毒1型(BHV-1)表達FMDV VP1基因[29]。此外，一些報道指出FMDV的P1-2A/3C的表達能夠誘導針對FMDV的保護性免疫[30]，將P1-2A/3C表達盒整合到BHV-1基因組中，發(fā)現(xiàn)FMDV 3C蛋白酶的表達會干擾BHV-1 的復制。將PRV糖蛋白gC基因插入到BHV-1的TK基因中，隨后構建了表達PRV的gB、gC、gD、gE基因的rBHV-I。但在該重組體中，gB基因和gD基因不能同時表達，因此又構建了能同時表達PRV糖蛋白gB、gC、gD、gE 和 gI的重組病毒BHV-1/TF17-1，對PRV攻擊有良好的免疫保護效果。2002年研究證實了表達PRV gB和gC基因的重組BHV-1/TF7-6在小鼠中誘導的免疫反應強于親本病毒。此外，還有少量以在BHV-1為載體表達其他病原的重組病毒被成功構建。例如，在gE啟動子后面表達牛呼吸道合胞病毒G蛋白的重組體能防止牛呼吸道合胞病毒的感染。在BHV-1 TK啟動子控制下表達牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白的重組體可作為候選疫苗。將在CAG啟動子控制下的隱孢子蟲的p23基因整合到BHV-1的gG基因中，得到的重組毒在兔體內(nèi)誘導產(chǎn)生了中和抗體。最新的研究結(jié)果表明大角羊肺炎的病原體的毒力基因插入BHV-1的gC位點構建的重組疫苗未能提供免疫保護作用[31]，但為其他肺炎病原體基因的插入提供了技術支持。除此之外，國內(nèi)的學者還構建了表達兔出血癥病毒、牛副流感病毒3型及牛流行熱病毒抗原基因的重組BHV-1，但均未進行免疫保護效力評價。

4 展望

近年來畜牧業(yè)臨床中密集的疫苗接種，導致病原體變異加速，部分傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)無法為動物提供良好的保護作用，免疫減負成為了需要關注的問題。病毒活載體疫苗雖然可以解決部分問題，但目前大部分的重組疫苗未得到商業(yè)化應用。主要的原因包括外源基因的插入影響載體病毒的復制和毒力，并且多個外源基因之間也可能存在相互影響，病毒基因組中殘留一些非必要的序列，影響重組疫苗的安全性，與其他疫苗共免疫時，不同疫苗之間產(chǎn)生不良的相互作用等。

為了進一步提高重組疫苗質(zhì)量，在構建病毒活載體重組基因工程疫苗過程中，幾點影響重組疫苗質(zhì)量的因素必須考慮：①了解載體與免疫系統(tǒng)之間的關系有助于病毒載體的開發(fā)；②外源基因密碼子的優(yōu)化可提高表達量；③啟動子的選擇影響外源基因的表達；④與某些細胞因子共表達可提高外源基因的免疫效果；⑤不同插入位點影響不同外源基因的表達量及穩(wěn)定性；⑥聯(lián)合免疫佐劑可增強黏膜免疫反應。基于這些現(xiàn)有的結(jié)論，在未來皰疹病毒載體疫苗或其他病毒載體疫苗的研發(fā)中有望進一步優(yōu)化重組疫苗的研發(fā)，從而能更加有效地控制畜禽疫病，提高經(jīng)濟效益，保護人和動物的健康。