馬 蕊, 阿爾祖古麗·買買提吐爾遜, 張衛(wèi)紅

新疆一種琥珀螺線粒體基因組測序分析

馬 蕊, 阿爾祖古麗·買買提吐爾遜, 張衛(wèi)紅

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室, 新疆 烏魯木齊 830046)

本研究利用高通量測序技術(shù)獲得采自新疆昭蘇琥珀螺科一未知種的線粒體全基因組序列。該種琥珀螺線粒體基因組全長14 219 bp, 由13個蛋白質(zhì)編碼基因, 22個tRNA基因, 2個rRNA基因及1個控制區(qū)組成?；蚪M中AT含量為76.43%, GC含量為23.57%, 表現(xiàn)出明顯的AT偏好性。13個PCGs多使用ATG為起始密碼子, TAA為終止密碼子。tRNA基因中和缺少DHU臂, 其中在缺失的DHU臂處有一個小的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。非編碼區(qū)位于與之間, 長度為58 bp。琥珀螺科中現(xiàn)有腐敗琥珀螺五家渠尖緣螺和的線粒體基因組被報道。三者的基因排列順序和結(jié)構(gòu)基本相似。昭蘇琥珀螺未知種的基因排列順序與它們有所不同。昭蘇琥珀螺未知種的和基因位于和之間, 上述三種和基因位于和之間。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示, 琥珀螺科的四種聚為一支, 為單系群, 其中腐敗琥珀螺和親緣關(guān)系更近。本研究結(jié)果支持昭蘇琥珀螺未知種為中國一未報道的屬種, 但要確定其是否為一新屬新種尚需更多的分子和形態(tài)數(shù)據(jù)。

新疆; 琥珀螺科; 高通量測序; 線粒體基因組

琥珀螺科Succineidae廣泛分布于世界各地, 是陸生軟體動物中較原始的類群。該科共分為3個亞科, 琥珀螺亞科Succineinae、原生琥珀螺亞科Catinellinae和尖緣螺亞科Oxylomatinae[1-2]。由于貝殼特征趨同明顯、許多屬種的解剖特征未知, 該科的種數(shù)和分屬(亞屬)情況目前仍不確定[3]。中國已報道該科2亞科3屬27種[4-6], 因為研究基礎(chǔ)不足, 一些屬種的分類有待厘定。目前, 該科僅有腐敗琥珀螺(Linneaus, 1758)、五家渠尖緣螺Li, Guo & Zhang, 2017和(d’Orbigny, 1836)的線粒體全基因組序列被報道[7-9]。本研究對采自新疆昭蘇一種琥珀螺的線粒體全基因組進行了測序分析, 研究結(jié)果可以豐富琥珀螺科分子數(shù)據(jù), 也可為該種琥珀螺的分類以及我國琥珀螺科系統(tǒng)分類研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

標本(標本號: XJU S13035)于2013年8月14日采自新疆伊犁昭蘇縣夏特柯爾克孜自治鄉(xiāng)東圖溝山溝公路邊巖石壁上(42°37.096′N, 80°34.880′E), 無水乙醇浸泡, –20 ℃保存于新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陸生貝類實驗室。

標本貝殼呈卵圓形, 殼厚, 不透明, 黃棕色, 殼面大部由于角質(zhì)層脫落呈灰白色, 有3.00～3.25個螺層; 殼高18.00～23.14 mm, 殼寬11.78～17.06 mm; 殼口高13.64～18.64 mm, 殼口寬9.84～12.80 mm。殼頂鈍圓。胚螺層光滑, 無螺紋。體螺層增長迅速, 殼面粗糙, 螺紋粗、稀疏?？p合線深。殼口卵圓形, 口緣完整、連續(xù)。無臍孔(圖1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及高通量測序

剪取腹足肌肉約30 mg, 用動物DNA組織提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA。DNA樣品送至上海天昊生物有限公司進行質(zhì)量檢測和文庫構(gòu)建, 質(zhì)檢合格的文庫片段在Illumina Hiseq平臺, 用2×150雙端測序策略進行序列測定。

圖1 實驗標本生態(tài)照片

1.2.2 序列處理及分析

用FASTP軟件去除原始序列中的低質(zhì)量序列, 包括長度低于100 bp, N超過3, 3′端堿基質(zhì)量低以及高質(zhì)量堿基(Phred score≥20)占比小于60%的序列。質(zhì)控后的序列以腐敗琥珀螺(Genbank No. JN627206)的線粒體基因組作為參考, 用MetaSPAdes軟件輸入雙端數(shù)據(jù)進行基因組組裝。使用Geneious R11.0軟件修正組裝結(jié)果, 分析堿基組成情況; 使用MITOS Webserver在線平臺注釋線粒體基因組, 預(yù)測tRNA二級結(jié)構(gòu)[10]; 使用CondonW軟件分析密碼子使用情況; 使用OGDRAW在線平臺繪制基因結(jié)構(gòu)圖[11]。

從GenBank中選取腹足綱9個物種的線粒體全基因組序列(表1), 用MEGA X軟件進行多序列比對, 選用最佳模型GTR(general time reversible model), 步長檢驗設(shè)定為1 000次, 以新腹足目Neogas-tro-po-da, 塔螺科Turridae的作為外群[7], 基于13個蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建最大似然法(maximum likeli-hood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

表1 腹足綱部分種類線粒體基因組序列GenBank登錄號

2 結(jié)果

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

實驗樣本經(jīng)Illumina Hiseq 2 500測序共獲得25 406 852條原始序列, 質(zhì)控后獲得23 358 662條序列, 對其進行拼接獲得昭蘇琥珀螺一未知種線粒體全基因組(GenBank No. OL681899), 長度14 219 bp, 為一閉合雙鏈DNA分子(圖2)。全基因組由37個基因組成, 包括13個蛋白質(zhì)編碼基因(protein coding genes, PCGs), 22個tRNA基因, 2個rRNA基因和1個控制區(qū)。昭蘇琥珀螺未知種線粒體全基因組A、T、G、C堿基的含量分別為33.79%、42.64%、12.75%、10.82%, 與琥珀螺科已知3種腐敗琥珀螺、五家渠尖緣螺和相似, 均具有明顯的AT偏向性(腐敗琥珀螺線粒體全基因組長度14 092 bp, AT含量為77.1%、GC含量22.9%; 五家渠尖緣螺線粒體全基因組長度14 086 bp, AT含量為75.6%、GC含量為24.3%;線粒體全基因組長度13 984 bp, AT含量為77.5%、GC含量為22.5%)(表2)。

昭蘇琥珀螺未知種的基因排列順序與同科的腐敗琥珀螺、五家渠尖緣螺和存在差異。腐敗琥珀螺、五家渠尖緣螺和的和基因位于和之間, 而昭蘇琥珀螺未知種的上述兩個基因位于和之間。

2.2 基因組組成

昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組序列中存在21處基因間隔, 最長的位于與之間, 長度141 bp; 存在12處基因重疊, 最長的位于NAD5與NAD1之間, 長度16 bp?；蚪M中有24個基因位于正鏈, 13個基因位于負鏈(表3)。

圖2 昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組結(jié)構(gòu)

表2 四種琥珀螺線粒體基因組堿基組成及偏向性

注: AT偏移 = (A–T) /(A + T); GC偏移 = (G–C) /(G + C)

表3 昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組組成

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

昭蘇琥珀螺未知種13個蛋白質(zhì)編碼基因長度在132 bp到1 635 bp之間, 總長10 415 bp, 其中AT含量為75.13%, AT偏移值為–0.21, GC值偏移值為0.08; 腐敗琥珀螺13個蛋白質(zhì)編碼基因全長10 830 bp, AT含量為78.04%, AT偏移值為–0.21, GC偏移值為0.04; 五家渠尖緣螺13個蛋白質(zhì)編碼基因全長10 678 bp, AT含量為75.64%, AT偏移值為–0.11, GC偏移值為0.04; 三者蛋白質(zhì)編碼基因長度和AT含量差異不大, 但五家渠尖緣螺AT偏移值較小。

昭蘇琥珀螺未知種13個蛋白質(zhì)編碼基因中除了和分別以TAA、TTG作為起始密碼子, 其余11個基因的為典型起始密碼子ATN; 除了和分別以TAG、T作為終止密碼子, 其余11個基因的終止密碼子為TAA。昭蘇琥珀螺未知種起始密碼子的使用情況除和之外, 其余11個基因與腐敗琥珀螺和五家渠尖緣螺的相似; 終止密碼子的使用也與二者存在一定差異, 主要出現(xiàn)在、、和上。

昭蘇琥珀螺未知種共編碼3 741個密碼子, 其中密碼子AGA(Arg)、UUA(Leu)、AGU(Ser)等的使用次數(shù)較高(圖3)。腐敗琥珀螺共編碼3 583個密碼子, 五家渠尖緣螺共編碼3 571個密碼子,共編碼3 607個密碼子, 三者使用次數(shù)較高的密碼子均為UUA (Leu) 、UUU(Phe) 、AUU(Ile), 與昭蘇琥珀螺未知種有所不同。編碼密碼子數(shù)均不含終止密碼子。

圖3 昭蘇琥珀螺未知種蛋白編碼基因同義密碼子使用頻率

2.4 tRNA、rRNA基因及控制區(qū)

昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組中22個tRNA基因總長為1 373 bp, 各基因長度在60 bp到73 bp之間, 其中AT含量為77.64%, GC含量為22.36%。tRNA基因二級結(jié)構(gòu)中,和基因缺少DHU臂,基因在缺失的DHU臂處有一小莖環(huán)結(jié)構(gòu), 其他基因均形成經(jīng)典的三葉草結(jié)構(gòu)。大多數(shù)后生動物線粒體基因組中基因缺DHU臂[13-14]。本文研究的4種琥珀螺中, 昭蘇琥珀螺未知種、腐敗琥珀螺和五家渠尖緣螺的和基因均缺少DHU臂, 而僅缺少DHU臂(圖4), 與大多數(shù)后生動物有所不同。

昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組中rRNA基因總長為1 761 bp, AT 含量為78.59%。(981 bp)位于和之間,(780 bp)位于和之間, 基因位置與同科3個已知種一致。昭蘇琥珀螺未知種線粒體基因組中有一段長度為54 bp的控制區(qū), 位于與之間; 腐敗琥珀螺中控制區(qū)長度50 bp位于與之間; 五家渠尖緣螺中控制區(qū)長度42 bp, 位于和之間, 三者有所不同。

圖4 四種琥珀螺線粒體基因組tRNA-Ser二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)生樹(圖5)結(jié)果顯示, 后鰓亞綱的種類聚為一支, 為單系群; 肺螺亞綱為非單系群, 與White等獲得的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致[7]。琥珀螺科的四個種聚為一支, 顯示共同的起源, 其中腐敗琥珀螺與的親緣關(guān)系最近, 而昭蘇琥珀螺未知種位于琥珀螺科所在分支的最基部, 關(guān)于它們的系統(tǒng)演化關(guān)系有待加入琥珀螺科更多種類的線粒體基因組數(shù)據(jù)進行分析。同源性比對結(jié)果顯示, 昭蘇琥珀螺未知種與五家渠尖緣螺線粒體基因組的相似性為75.8%, 與腐敗琥珀螺的相似性為77.4%, 與的相似性為78.7%,與腐敗琥珀螺的相似性為80.8%, 腐敗琥珀螺與的相似性最高, 與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。

圖5 基于線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的最大似然樹

3 討論

昭蘇琥珀螺未知種目前已知僅在新疆昭蘇縣夏特鄉(xiāng)有分布, 生境為較干燥的山地環(huán)境。琥珀螺科的種類貝殼一般較小, 殼高大多1 cm左右。昭蘇琥珀螺未知種貝殼較大, 殼高2 cm左右。楊呂娟在其碩士論文中對本文研究的昭蘇琥珀螺未知種的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)進行了描述, 認為其陰莖結(jié)構(gòu)與琥珀螺科已知屬種存在明顯差異, 將其定為一新屬新種[15]。阿爾祖古麗·買買提吐爾遜在其碩士論文中進一步依據(jù)、和基因的分析, 支持楊呂娟的結(jié)果[16]。

琥珀螺科目前已有3個種的線粒體全基因組被報道。本研究昭蘇琥珀螺未知種的線粒體全基因組與三者相比差異較大。主要差異在于, 第一, 線粒體基因組基因排列順序不同, 昭蘇琥珀螺未知種的和基因位于和之間, 而腐敗琥珀螺、五家渠尖緣螺和的和基因位于和之間; 第二,基因二級結(jié)構(gòu)存在差異, 昭蘇琥珀螺未知種在基因缺失的DHU臂處有一小莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本研究系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果也顯示, 昭蘇琥珀螺未知種位于琥珀螺科所在分支的最基部, 未與其他三種琥珀螺中的任何一種單獨聚為一支, 應(yīng)當不屬于這三種所在的屬, 即不屬于Westerlund, 1885、Draparnaud, 1801和d’Orbigny, 1838(該屬僅分布于美洲和加勒比群島)。我國琥珀螺科共報道三個屬,Matekin, 1956、和, 其中在新疆沒有分布[4-6]。結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù), 昭蘇琥珀螺未知種也不屬于屬, 應(yīng)為中國一未報道的屬種。因為楊呂娟和阿爾祖古麗·買買提吐爾遜的研究結(jié)果尚未正式發(fā)表, 目前琥珀螺科線粒體全基因以及其他分子數(shù)據(jù)有限, 本文仍將所研究采自昭蘇的蝸牛定為琥珀螺科一未知種。

4 結(jié)論

本研究獲得新疆昭蘇琥珀螺未知種線粒體全基因組序列, 對其堿基組成、基因排列順序、各類基因的結(jié)構(gòu)特征等進行了分析, 并與琥珀螺科已知3個種的線粒體全基因組序列進行了比較。結(jié)果顯示, 四者基因組長度、堿基含量相似; 基因位置、蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用情況、tRNA基因二級結(jié)構(gòu)、控制區(qū)的位置等存在一定差異, 其中昭蘇琥珀螺未知種與其他三種的差異較大。昭蘇琥珀螺未知種應(yīng)為中國一未報道的屬種, 但要確定其是否為一新屬新種尚需更多的分子和形態(tài)數(shù)據(jù)。

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Complete mitochondrial genome of a succineid species from Xinjiang

MA Rui, AERZUGULI Maimaitituerxun, ZHANG Wei-hong

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

The complete mitochondrial genome of an unknown succineid species from Zhaosu, Xinjiang, was obtained using high-throughput sequencing technology. The mitochondrial genome of this species was 14, 219 bp in length with a high AT bias of 76.43%, containing 13 protein coding genes (PCGs), 22 tRNA genes, two rRNA genes and one control region. Most PCGs used ATG as the start codon and TAA as the stop codon. Among the tRNA genes,andlacked a DHU arm, andhad a small stem-loop structure at the location of the missing DHU arm. The control region was 58 bp in length and was located betweenand. The complete mitogenome of,, andhas been reported in the family Succineidae.The gene arrangement and structures of these three species were basically the same but different from the unknown species from Zhaosu. Theandgenes of the species from Zhaosu were located betweenand, while the two genes of the three species were located betweenand. The phylogenetic tree revealed that four species of Succineidae were clustered in one clade, suggesting a monophyletic group, whereasandwere more closely related than the other two species. The results of this study support that the succineid species from Zhaosu is an undescribed species in China. However, more molecular and morphological data are needed to determine whether this is a new genus and species.

Xinjiang; Succineidae; high-throughput sequencing; mitochondrial genome

Oct. 22, 2021

Q959.212

A

1000-3096(2022)10-0159-08

10.11759/hykx20211022001

2021-10-22;

2022-03-07

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2020D01C043)

[Science and Technology Planning Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2020D01C043]

馬蕊(1998―), 女, 回族, 青海西寧人, 碩士, 主要從事貝類系統(tǒng)分類學(xué)研究, E-mail: 13119761810@163.com; 張衛(wèi)紅(1968―),通信作者, 主要從事貝類系統(tǒng)分類學(xué)研究, E-mail: zwh6879a@163.com

(本文編輯: 楊 悅)