○蔣翠紅 楊翼羽 于林海 郭貴良

（長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心 吉林長春 130000）

孔雀石綠是水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁用的一種三苯甲烷類染料，因其對治療魚的水霉病具有特效且價(jià)格低廉，加之宣傳力度不夠等原因，使得不少養(yǎng)殖戶還在小范圍使用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠在生物體內(nèi)有明顯蓄積現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致水生生物脊椎、頭和背鰭等部位畸變，卵染色體發(fā)生異常，對哺乳動(dòng)物具有高毒、高殘留、致癌、致畸和致突變等副作用，殘留時(shí)間達(dá)100天以上，食用含孔雀石綠的水產(chǎn)品，會(huì)對人體健康產(chǎn)生危害，因此準(zhǔn)確測定水產(chǎn)品中孔雀石綠具有重要意義。目前，國內(nèi)檢測部門通用的方法是GB/T 20361-2006高效液相色譜熒光檢測器法，但該法前處理繁瑣、耗時(shí)，溶液轉(zhuǎn)移次數(shù)多，易造成損失。本文參考GB/T 20361-2006法，根據(jù)實(shí)際檢測工作，探討并優(yōu)化了提取、萃取等影響檢測的環(huán)節(jié)，建立一種前處理簡便、快捷，回收率穩(wěn)定的水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的檢測方法。

1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

（1）乙腈為色譜純；二氯甲烷、硼氫化鉀溶液、酸性氧化鋁和乙酸銨等為分析純；水為超純水。Agilent酸性氧化鋁固相萃取柱（500mg，3mL）；Agilent PRS固相萃取柱（500mg，3mL）；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（98.0%±0.2%）購置于德國Dr公司。

（2）精確稱取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，用乙腈定容到100.00mL，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18℃避光保存。使用前稀釋成需要濃度。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜（配熒光檢測器FLD），離心機(jī)，漩渦振蕩器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，固相萃取裝置，超聲萃取儀，組織攪碎機(jī)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

將水產(chǎn)品用清水淋洗干凈。魚去鱗、去皮，沿背脊取肌肉部分；蝦去頭、殼、腸腺，取肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分。樣品切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混合，攪碎混勻，四分法取樣。所取樣品分為2份，一份供測定，另一份放置于-20℃冰箱中保存，備用。

2.2 提取

①稱取5.00g樣品于50mL離心管內(nèi)，加入10mL乙腈，加入5g酸性氧化鋁，振蕩2分鐘，超聲波5分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，3mL0.2mol/L硼氫化鉀溶液，振搖2分鐘。②在離心管中加入10mL乙腈，3mL0.2mol/L硼氫化鉀溶液，用玻棒搗散離心管中的沉淀并攪勻，漩渦混勻器上振蕩1分鐘，靜置20分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液并入125mL分液漏斗中。③在離心管中繼續(xù)加入1.5mL鹽酸羥胺溶液、2.5mL對-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸銨緩沖溶液，振蕩2分鐘，再加入10mL乙腈，繼續(xù)振蕩2分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液并入125mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入25mL二氯甲烷，具塞，劇烈振搖2分鐘，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)移至250mL雞心瓶中，繼續(xù)在分液漏斗中加入5mL乙腈、15mL二氯甲烷，振搖2分鐘，靜置分層，將下層溶液合并至250mL雞心瓶，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2.5mL乙腈溶解殘?jiān)?/p>

2.3 凈化

將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，上端連接酸性氧化鋁固相萃取柱，用5mL乙腈活化，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，再用乙腈洗雞心瓶兩次，每次2.5mL，依次過柱，棄去酸性氧化鋁柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情況下，加入3mL等體積混合的乙腈和乙酸銨溶液（pH=10），收集洗脫液，乙腈定容至3mL，供液相色譜測定。

2.4 測定

2.4.1 高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent ODS-C18柱（內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒度5μm）；流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨溶液（80∶20）；流速1.3mL/分鐘；柱溫35℃；激發(fā)波長265nm；發(fā)射波長360nm；進(jìn)樣量20μL。

2.4.2 色譜分析 將配好的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品提取液置于液相色譜儀的樣品盤中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性（圖1），外標(biāo)法定量（圖2）。

圖1 10 ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品提取優(yōu)化

（1）GB/T 20361-2006法中提取只采用勻漿機(jī)以10000r/分鐘的速度均質(zhì)30s，勻漿只可以打碎一部分細(xì)胞，提取不完全。而本方法則采用組織攪碎機(jī)攪碎結(jié)合超聲破碎的方法提取樣品，同時(shí)省去了GB/T 20361-2006法中另取離心管加乙腈洗滌勻漿機(jī)刀頭的步驟，防止了用勻漿機(jī)勻漿增加加標(biāo)損失，影響回收率。隱色孔雀石綠是孔雀石綠在生物體中的代謝產(chǎn)物，存在于細(xì)胞內(nèi)，超聲提取彌補(bǔ)了勻漿機(jī)的不足，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞破壁提取，使組織內(nèi)成分提取更加完全，有利于目標(biāo)物的溶出，提高回收率。此外，超聲時(shí)間需要控制，時(shí)間過長容易引入較多的雜質(zhì)，時(shí)間過短會(huì)造成提取不完全。有研究表明，超聲提取以5分鐘為宜。

（2）GB/T 20361-2006方法的樣品前處理過程中，樣品要經(jīng)歷4次采用乙腈提取結(jié)合4次離心獲得目標(biāo)物提取液，提取步驟多，成本高，影響回收率。為此，本方法省去第4步用乙腈提取并離心的步驟，這與2016年農(nóng)業(yè)部組織的水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢測能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書中要求的相一致，減少了提取步驟，降低了成本，提高了工作效率。

3.2 樣品液液萃取優(yōu)化

在實(shí)際樣品前處理過程中，水相與有機(jī)相的比例影響二者的分層效果，比例不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致兩相倒置、兩層界面模糊、乳化等現(xiàn)象。GB/T 20361-2006法采用液相法，用二氯甲烷進(jìn)行反萃取時(shí)，第一次加入20mL二氯甲烷，第二次加入10mL二氯甲烷，由于乙腈對水的溶解度較大，分層不明顯，萃取效率低下，且容易使二氯甲烷發(fā)生倒相的現(xiàn)象，同時(shí)，有研究表明，試驗(yàn)中水相的存在有助于去除樣品中水溶性雜質(zhì)，因此水相的比例也不能過低。對此，本方法增加了二氯甲烷的用量，第一次加入25mL，第二次加入15mL，以使二氯甲烷相處于下層，避免了倒相，并且第二次萃取不用離心，仍用分液漏斗，分層效果也很明顯，既縮短了分離時(shí)間，又提高了提取效率。

3.3 樣品過濾膜改進(jìn)

由于市面上的濾膜質(zhì)量參差不齊，有時(shí)出現(xiàn)一些濾膜的雜峰，干擾出峰，使得譜圖不美觀，所以本方法將過柱提取液直接于刻度管中定容上機(jī)測定，節(jié)約了成本，提高了效率。

本方法目標(biāo)峰能與其它雜質(zhì)峰完全分離，峰形較好。

4 小結(jié)

本方法在GB/T 20361-2006法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動(dòng)和離心，且經(jīng)超聲提取，提高了目標(biāo)物的溶出效果，減少了勻漿帶來的損失，提高了回收率，同時(shí)，省去了第4步用乙腈提取并離心，減少了提取步驟，降低了成本；在萃取步驟增加了二氯甲烷用量，且第二次萃取不用離心，防止了倒相，縮短了分離時(shí)間，又提高了提取效率；實(shí)驗(yàn)最后不用過濾膜過濾直接上機(jī)進(jìn)行測定，節(jié)省了消耗品的成本，也避免了雜峰的干擾。需特別注意的是在樣品前處理的過程中，應(yīng)避免強(qiáng)光直射。結(jié)果表明，經(jīng)改進(jìn)的方法用于檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量簡便、快捷，出峰時(shí)間縮短，提高了工作效率，適用于日常水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢測工作的需要。當(dāng)然，在今后的工作中筆者會(huì)繼續(xù)對水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量測定的前處理方法進(jìn)行進(jìn)一步研究、不斷改進(jìn)，使之更加完善。