吳學(xué)芳，李 微

(1.昆山市玉山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇 昆山 215316；2.昆山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 昆山 215300)

套式PCR法檢測白斑綜合征病毒(WSSV)因操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點而被縣級實驗室廣泛應(yīng)用。但基層實驗室由于缺少專職實驗操作員、管理較為松散等原因，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶問題。近年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部每年開展水生動物防疫系統(tǒng)實驗室檢測能力驗證工作，要求已經(jīng)建成運行的縣級水生動物防疫站至少參加一種疫病的實驗室能力驗證項目。白斑綜合征(WSD)由于發(fā)病率高、引起水產(chǎn)動物死亡率高從而成為眾多縣級實驗室選擇的檢測項目。

昆山市水生動物疫病預(yù)防控制中心自2015年起開展WSSV的實驗室檢測工作，參照《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測法》(GB/T 28630.2-2012)嚴(yán)格執(zhí)行。然而，在實驗過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶。筆者與江蘇省內(nèi)多家縣級水生動物防疫站交流后發(fā)現(xiàn)，以上兩個問題在多家實驗室普遍存在。本文對套式PCR法檢測WSSV假陽性和非特異性條帶兩個問題形成的原因加以分析，并提出預(yù)防和解決方法，旨在為廣大基層實驗室提供參考。

一、假陽性

1.形成原因

套式PCR的原理是采用兩步法進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，第二步PCR以第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板。這種方法檢測靈敏度非常高，即使在反應(yīng)體系中出現(xiàn)了極其微量的模板污染，也會造成假陽性。

(1)首次假陽性。由于縣級防疫實驗室的檢測人員并非專職實驗操作員，一般為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)技術(shù)推廣部門的工作人員兼職負(fù)責(zé)，所以在操作過程中，可能會出現(xiàn)槍頭非一次性使用、動作幅度過大、手套未及時更換、PCR陽性產(chǎn)物不慎溢出等不當(dāng)操作，這些都是導(dǎo)致假陽性的原因。

(2)非首次假陽性。往往出現(xiàn)一次假陽性后，隨著短期內(nèi)實驗次數(shù)的增加，假陽性發(fā)生的概率也會隨之加大，這是由于在首次出現(xiàn)假陽性后，實驗操作臺、儀器設(shè)備和試劑耗材均有可能被污染，空氣中也可能存在目的片段氣溶膠顆粒。

2.預(yù)防措施

假陽性一旦出現(xiàn)則很難消除，做好預(yù)防工作是十分必要的，具體做好以下3點。

(1)規(guī)范實驗操作?？h級防疫站要加強對實驗操作人員的理論培訓(xùn)和實操培訓(xùn)，使其增強意識和提升操作能力，盡可能地減少污染發(fā)生。特別要加強對移液器規(guī)范使用的培訓(xùn)，很多污染都是由于移液器使用不當(dāng)造成的。

(2)嚴(yán)格實驗分區(qū)。嚴(yán)格區(qū)分樣品處理室、反應(yīng)體系配制室、PCR擴(kuò)增室和電泳室等。實驗分區(qū)的好處是一旦出現(xiàn)污染，可控制在某一單獨區(qū)域或少數(shù)區(qū)域，而其他區(qū)域仍可正常使用，大大提高后續(xù)實驗的成功率。

(3)重視消毒。在每次PCR實驗結(jié)束后都要消毒，地面和工作臺面用含氯消毒液擦拭，儀器設(shè)備要用75%酒精擦拭。此外，在實驗開始前，要對用到的吸頭、離心管等進(jìn)行高溫高壓滅菌消毒。

3.解決方法

發(fā)現(xiàn)WSSV假陽性現(xiàn)象后，可采取以下幾條措施加以解決。

(1)整體空間用紫外燈照射。消毒液和高溫高壓滅菌消毒僅能滅活WSSV，并不能破壞目的片段DNA分子。在出現(xiàn)假陽性后，縣級實驗室可使用移動式紫外燈對各實驗區(qū)域分別進(jìn)行照射消毒，使DNA分子斷裂，從而降低假陽性發(fā)生的概率。

(2)加強通風(fēng)。在假陽性出現(xiàn)后，實驗員往往會繼續(xù)開展多次實驗以求達(dá)到正確的實驗結(jié)果，這樣就會造成一定空間內(nèi)目的片段DNA分子濃度的不斷升高，假陽性現(xiàn)象不但沒有消除，還會愈加嚴(yán)重。在發(fā)生這種情況時，除無菌操作間外，其他區(qū)域要及時打開門窗通風(fēng)，保證通風(fēng)數(shù)小時以上，以達(dá)到稀釋污染物的目的。

二、非特異性條帶

1.形成原因

套式PCR法檢測WSSV，雖然特異性較高，但有時也會出現(xiàn)非特異性條帶的擴(kuò)增現(xiàn)象，這些非特異性條帶一般為多條，濃度較低。由于實驗采用國標(biāo)法，所以排除引物設(shè)計不合理和退火溫度不合適這兩個因素，主要考慮以下因素。

(1)模板不純。DNA提取方法不合適或者實驗操作不當(dāng)，引起模板中含有組蛋白、Taq酶抑制劑等雜質(zhì)。

(2)酶失活。Taq酶保存不當(dāng)，造成酶活性降低或者失活。

(3)引物問題。引物質(zhì)量不好或者兩條引物濃度一條高一條低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增。

2.預(yù)防和解決方法

相較于假陽性，非特異性條帶問題可較好預(yù)防和解決。實驗人員平時要注重Taq酶的低溫保存，酶要存放于-20℃，并每年重新采購，以防過期失活。稀釋引物時，要嚴(yán)格按照國標(biāo)法規(guī)定的濃度進(jìn)行稀釋，不得隨意更改濃度。引物應(yīng)分裝后低溫保存，切忌反復(fù)凍融造成降解。

實驗室日常運行過程中要規(guī)范管理，保證室內(nèi)環(huán)境的清潔，并安排專人負(fù)責(zé)儀器設(shè)備的維護(hù)和試劑管理。PCR實驗需由經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的人員完成。在出現(xiàn)假陽性或非特異性條帶問題后，要及時分析原因，消除不利因素，以保證獲得正確的實驗結(jié)果，提高為養(yǎng)殖生產(chǎn)服務(wù)的能力。