劉玉玲，劉利，鄧佳麗，郭祉良

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽 032200；2.山西省汾陽醫(yī)院，山西汾陽 032200）

蟾蜍靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥的主要活性成分之一，具有抗癌、鎮(zhèn)痛等多種作用[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈可作用于腫瘤，但其研究過程中對正常細(xì)胞毒副作用的報道卻較少[2-5]。本研究通過蟾蜍靈處理體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，了解蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞的毒性作用，為其應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟾蜍靈（含量≥98%，MB7115），大連美倫生物科技有限公司，使用時用無水乙醇配成1 mmol/L的母液，根據(jù)使用需要將母液稀釋為相應(yīng)濃度；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（penicillin-streptomycin）（批號：B540732）、乙醇（批號：A500737）、DMEM培養(yǎng)基（批號：E600003），胰蛋白酶（批號：A003702），噻唑藍(lán)（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）（批號：A100793）、二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（批號：A100231），生工生物（上海）股份有限公司；小牛血清（批號：11011-8611），杭州四季青生物工程材料有限公司。

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1為山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院檢驗(yàn)系張笑添老師贈予。

1.2 儀器與設(shè)備

Galaxy 170S二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國FINEPCR公司；Infinite F50型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；DM500光學(xué)顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)2～3 d，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化，計數(shù)并放于培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測GES-1細(xì)胞抑制率

取對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，充分混勻制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔2 000個細(xì)胞，100 μL/孔，放置過夜。細(xì)胞貼壁后，分別加入蟾蜍靈（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），每組設(shè)立3個復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，向每孔中加入20 μL MTT溶液（工作濃度為5 mg/mL）混勻繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄孔中培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μL DMSO，放置10 min。用酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀在450 nm處測定吸光值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算細(xì)胞生存率。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的蟾蜍靈（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培養(yǎng)48 h后，放置在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測

采用熒光探針DCFH-DA檢測GES-1細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量，終濃度為10 μmol/L。DCFH-DA被ROS氧化為二氯熒光黃（DCF），產(chǎn)生綠色，通過細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，即可相對定量細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)時，細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的蟾蜍靈（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培養(yǎng)48 h后，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，向細(xì)胞中加入100 μL稀釋好的DCFH-DA工作液，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，然后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，放置熒光顯微鏡下觀察DCFH-DA的熒光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prim6統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示；采用t檢驗(yàn)對不同實(shí)驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蟾蜍靈對人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1生存率的影響

以 0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L濃度的蟾蜍靈作用GES-1細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，通過MTT檢測細(xì)胞的生長水平。如圖1所示，在蟾蜍靈處理細(xì)胞24 h時，與對照組（0 nmol/L）相比，1～100 nmol/L的蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞無殺傷作用（P＞0.05）；而蟾蜍靈作用細(xì)胞48 h和72 h時，隨著藥物濃度的增加，與對照組（0 nmol/L）相比，GES-1細(xì)胞的生長受到了明顯抑制，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)[6]，用0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的蟾蜍靈處理細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同條件下蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞生存率的影響

2.2 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，蟾蜍靈濃度為0 nmol/L時，細(xì)胞的形態(tài)呈梭形，且細(xì)胞密度較高；隨著蟾蜍靈濃度的增加，GES-1細(xì)胞的形態(tài)由梭形向圓形轉(zhuǎn)變，體積減小，細(xì)胞的密度也相應(yīng)降低。

圖2 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞中ROS含量的影響

細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。如圖3所示，隨著蟾蜍靈處理濃度的增加，GES-1細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度增加，表明高濃度的蟾蜍靈可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，使其含量增加。

圖3 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞中ROS含量的影響

3 討論

許多研究報道，蟾蜍靈通過不同的途徑抑制肝癌、肺癌、腸癌以及胃癌等多種腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[2-8]。張瀅等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度蟾蜍靈在處理正常肝細(xì)胞LO224 h時，蟾蜍靈對正常肝細(xì)胞無殺傷作用，在48 h和72 h時，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，蟾蜍靈對正常肝細(xì)胞有一定的抑制作用。也有研究報道濃度小于20 nmol/L的蟾蜍靈作用正常宮頸細(xì)胞48 h時，對正常宮頸細(xì)胞的生長沒有抑制作用[5]。

本研究利用不濃度蟾蜍靈分別作用于人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 24 h、48 h和72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理24 h時，不同濃度的蟾蜍靈對GES-1細(xì)胞無殺傷作用。但是隨著作用時間的延長，蟾蜍靈表現(xiàn)出抑制GES-1細(xì)胞的生長并影響細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，而大量ROS是引起細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的重要因素，如造成DNA的損傷、蛋白酶活性的氧化等[10-11]。

目前針對腫瘤的治療方法多為手術(shù)切除和術(shù)后化療等，但該種方法治療效果差，且易于復(fù)發(fā)。因此，人們開始尋找有效的藥物進(jìn)行治療，同時要最大限度地降低藥物對自身正常細(xì)胞的毒性。本實(shí)驗(yàn)初步研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的蟾蜍靈在一定的作用時間內(nèi)，對正常胃黏膜上皮細(xì)胞無殺傷作用。這為蟾蜍靈以后作為腫瘤治療藥物提供了參考依據(jù)。