劉鑒，戴佳琳

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001）

阿米巴痢疾是一種常見(jiàn)的寄生蟲腸道感染，在全球均有流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，每年約有5 000萬(wàn)人發(fā)生感染，可導(dǎo)致4萬(wàn)～11萬(wàn)人死亡，嚴(yán)重危害人們的身體健康和生命安全[1-3]。由于白頭翁（Pulsatilla chinensis）有清熱解毒、涼血止痢的功效，在臨床上治療細(xì)菌性痢疾和阿米巴痢疾均具有較好的療效，但由于具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，從單一角度評(píng)價(jià)其藥理機(jī)制具有一定的挑戰(zhàn)性[4-5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法，研究白頭翁治療阿米巴痢疾的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

白頭翁主要成分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)，包括活性成分及其靶基因。腸道疾病相關(guān)基因從4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)）中檢索獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有效成分及疾病靶標(biāo)的篩選

白頭翁主要成分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，配體篩選使用SwissADME工具。腸道疾病相關(guān)基因從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[6]、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。使用SwissADME工具評(píng)估白頭翁的藥代動(dòng)力學(xué)“ADMET”特性[7]，獲得關(guān)鍵的分子配體。

1.2.2 藥物有效成分和疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)及核心基因的篩選

使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建白頭翁有效成分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用DAVID進(jìn)行GO和KEGG通路分析。使用R軟件4.0.2中的“ggplot2”包生成圖形，將白頭翁成分靶標(biāo)和腸道疾病相關(guān)基因集上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.2.3 分子對(duì)接

采用AutoDockvina進(jìn)行分子對(duì)接，選取自由結(jié)合能最低的結(jié)合構(gòu)象，使用PyMol軟件和Discovery Studio軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 白頭翁活性成分和潛在靶標(biāo)的篩選

根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出9個(gè)活性成分，從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出72個(gè)藥物靶基因。此外，從Genecards、OMIM、PharmGkb和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索腸道疾病相關(guān)基因。收集藥物和疾病的交點(diǎn)靶點(diǎn)作為共同基因，其可能是治療中的潛在靶點(diǎn)，最終得到一組白頭翁靶基因和腸道疾病相關(guān)基因共68個(gè)。

2.2 白頭翁有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將9個(gè)有效成分和目標(biāo)基因?qū)隒ytoscape網(wǎng)絡(luò)可視化探索有效成分之間的關(guān)系和相應(yīng)的靶基因，見(jiàn)圖1。計(jì)算的鏈接價(jià)值（學(xué)位價(jià)值）為靶基因的數(shù)量直接相關(guān)組件，高連鎖值表明該基因在網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置。通過(guò)對(duì)其活性成分“ADMET”特性的評(píng)價(jià)，確定白頭翁的藥物代謝學(xué)特征。在9個(gè)有效成分中，Aureusidin（MOL001978）和Isorhamnetin（MOL000354）可以很好地被消化道吸收，但是Isorhamnetin是細(xì)胞色素P450（CYP）同工酶CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的抑制劑，使其他藥物或本身代謝減慢，血藥濃度升高，提高藥效。因此，筆者推測(cè)Isorhamnetin在治療中可以起到關(guān)鍵作用。

圖1 有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 富集分析及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

富集分析發(fā)現(xiàn)，基因主要富集在類固醇激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)膜電位、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路，表明白頭翁通過(guò)多種途徑作用于腸道系統(tǒng)。將目的基因?qū)氲紺ytoscape中，使用插件CytoNCA計(jì)算DC、BC、C、EC、NC 和 LAC共6個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)估交互網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩?。第一次篩選獲得19個(gè)節(jié)點(diǎn)和102個(gè)邊，第二次篩選獲得7個(gè)節(jié)點(diǎn)和19個(gè)邊（見(jiàn)圖2），最終獲得了7個(gè)重要基因（AR、CASP3、ESR1、HSP90AA1、JUN、PTGS2和RELA），涉及對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)膜電位、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等。以上結(jié)果表明，白頭翁具有多成分、多靶標(biāo)作用，其中RELA參與PI3K/Akt信號(hào)通路，該通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起重要作用。此外，還影響PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，可改善腸道微生物群，達(dá)到緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用[8]。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浜Y選過(guò)程

2.4 分子對(duì)接

將活性成分分別與大分子蛋白進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)化合物Isorhamnetin除了JUN無(wú)氫鍵連接外，其余均可與氫鍵相連形成穩(wěn)定的化合物。其中化合物Isorhamnetin與RELA蛋白通過(guò)3個(gè)氫鍵分別與3個(gè)氨基酸殘基結(jié)合，呈現(xiàn)出緊湊的結(jié)合模式?；衔锱c殘基TYR-98形成鍵長(zhǎng)為2.2 ?的氫鍵，與氨基酸殘基LYS-102形成距離為2.2 ?的氫鍵，與殘基GLU-49形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為2.8 ?。這些相互作用使得蛋白與化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物（見(jiàn)圖3），由此可以推測(cè)白頭翁中Isorhamnetin與RELA結(jié)合后，通過(guò)抑制PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路，以拮抗炎癥的發(fā)生發(fā)展，從而達(dá)到治療的目的。

圖3 對(duì)接結(jié)果可視化模式

3 結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，對(duì)白頭翁的活性成分及其分子機(jī)制進(jìn)行了探討。其有效成分Isorhamnetin和7個(gè)大分子蛋白（AR、CASP3、ESR1、HSP90AA1、JUN、PTGS2和RELA）對(duì)接后，除了JUN無(wú)氫鍵連接外，其余均可與氫鍵相連形成穩(wěn)定的化合物，表明白頭翁具有多成分、多靶標(biāo)作用；白頭翁活性成分與RELA蛋白呈現(xiàn)出緊湊的結(jié)合模式，通過(guò)抑制PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路后，以拮抗炎癥的發(fā)生發(fā)展。綜上，可推測(cè)RELA是治療腸阿米巴痢疾的潛在靶點(diǎn)。