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        丹參酮提取物的急性毒性及抗炎試驗(yàn)研究

        2022-11-24 09:40:46陶蕾王廣宇王明彥陳彥亮樊志強(qiáng)
        生物化工 2022年5期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        陶蕾,王廣宇,王明彥,陳彥亮,樊志強(qiáng)

        (1.蘭州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.三門峽廣宇生物制藥有限公司,河南三門峽 472400;3.河南省中藥材生產(chǎn)技術(shù)推廣中心,河南鄭州 450000)

        從丹參中提出丹參酮,主要成分包括丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ A、丹參酮Ⅱ B、隱丹參酮以及異隱丹參酮等十多個(gè)丹參酮個(gè)體,丹參酮具有清除氧自由基、抑制炎癥細(xì)胞增殖、抗菌等作用。前期體外抑菌研究結(jié)果顯示,丹參酮對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用。丹參酮不僅具有廣譜抗菌作用,還有類雌激素活性和抗雄激素效應(yīng),可以減少白細(xì)胞的氧自由基釋放,抑制白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、內(nèi)皮素以及腫瘤壞死因子α等不同炎性因子的釋放,降低血前列腺素F2a與前列腺素E水平,降低免疫復(fù)合物所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[1]。奶牛乳房炎是由于乳腺在化學(xué)、物理、微生物等因素刺激下而導(dǎo)致奶牛乳房的炎癥,可分為臨床型、亞臨床型和非臨床型乳房炎,是奶牛較為常見的一種多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球2億多頭奶牛中約有30%的奶牛患有各類乳房炎疾病,帶來的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)300億人民幣,嚴(yán)重威脅奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。目前,奶牛乳房炎主要通過注射抗菌藥物以及乳房灌注治療,抗感染藥物作用迅速,針對(duì)性強(qiáng),但存在易產(chǎn)生耐藥性和獸藥殘留的問題[3]。丹參酮具有低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn),具有廣闊的發(fā)展前景。本文旨在通過評(píng)價(jià)其毒性及抗炎作用,為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        丹參酮提取物,隱丹參酮含量為3%;丹參酮ⅡA含量為11%;大豆油,食品級(jí),山東魯花集團(tuán)有限公司;角叉菜膠,食品級(jí),山東滕望化工有限公司。

        氫化可的松注射液(2 mL×10支/盒),三門峽廣宇生物制藥有限公司;青霉素、磷酸地塞米松、伊文思藍(lán)、二甲苯、冰醋酸、甲醇、氫氧化鉀、乙醚,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Ml104/02電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;XT4000i血液細(xì)胞分析儀,日本SYSMEX公司;AU5800生化分析儀,貝克曼庫爾特國際貿(mào)易(上海)有限公司;D-37520低溫高速離心機(jī),美國Thermo scientific公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        昆明小鼠,雌雄各半,體重18~22 g,購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 急性毒性試驗(yàn)(LD50)

        將60只小鼠雌雄各半分成6組,一組為對(duì)照組,余下5組分別按2 060 mg/kg、2 580 mg/kg、3 230 mg/kg、4 040 mg/kg和5 050 mg/kg體重給藥,實(shí)驗(yàn)藥品均用大豆油溶解,對(duì)照組給予大豆油灌胃,劑量為5 000 mg/kg體重,觀察48 h小鼠的死亡情況。

        1.4.2 丹參酮提取物的抗炎試驗(yàn)

        1.4.2.1 耳發(fā)炎腫脹模型

        將60只昆明小鼠雌雄各半分為3組,第一組丹參酮提取物腹腔注射,給藥劑量為425 mg/kg;第二組氫化可的松注射,給藥劑量為420 mg/kg。每日對(duì)小鼠注射丹參提取物1次,持續(xù)4 d;模型組給予同樣體積的生理鹽水。在小鼠右耳兩面涂抹二甲苯,致炎1 h后處死,沿耳廓基線剪下雙耳,用直徑為9 mm的打孔器在左、右耳相對(duì)稱部位取下耳片稱重,計(jì)算耳廓腫脹度[4]。耳廓腫脹度=右耳廓重-左耳廓重。

        1.4.2.2 小鼠毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)

        與1.4.2.1給藥相同,將60只昆明小鼠雌雄各半分成3組,將僅注射生理鹽水的模型組作為對(duì)照組,與其他用藥組(兩組)進(jìn)行對(duì)比。所有小鼠進(jìn)行最后一次給藥后,觀察其基本特征,確定無異樣后于小鼠尾部靜脈注射伊文思蘭溶液(0.2 mL/只),同時(shí)注射0.7%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g)使其出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。確定炎癥反應(yīng),觀察20 min后處死并打開腹腔,使用不超過4 mL的生理鹽水對(duì)腹腔進(jìn)行沖洗并收集沖洗液,常規(guī)離心后靜置30 min取上清液采用紫外光度計(jì)測定OD值,并進(jìn)一步計(jì)算小鼠腹中的伊文思蘭和成分占比[5]。

        1.4.2.3 小鼠足跖腫脹及前列腺素E2(PEG2)滲出試驗(yàn)

        將60只昆明小鼠雌雄各半分為3組,在最后一次給藥結(jié)束后觀察30 min,確定所有小鼠無異樣后于每只小鼠右后足足趾部位進(jìn)行皮下注射,致炎藥物使用1%角叉菜膠0.03 mL(0.024 1 g)。4 h后處死小鼠,切下左右后足并精確測量其重量,通過對(duì)比左右兩側(cè)后足重量計(jì)算足趾腫脹率,足趾腫脹率(%)=(右后足重-左后足重-致炎劑)/左后足重。后將發(fā)生炎癥反應(yīng)的右足剝除表皮,并置于2.5 mL的生理鹽水中維持2 h以上,常規(guī)離心后靜置30 min,將上清液分離后取少量樣本(0.5 mL)與甲醇溶液(2 mL 0.5 mol/L KOH)混合水浴,在相同溫度條件下維持20 min,使其異構(gòu)化。后置于甲醇溶液中,待總量升至5 mL時(shí)在紫外光度計(jì)下測量OD值,以表示溶液中PEG2含量[6]。

        1.4.2.4 小鼠紙片肉芽腫試驗(yàn)

        將40只昆明小鼠雌雄各半分為兩組,在無菌操作下對(duì)所有小鼠進(jìn)行濾紙片移植手術(shù),濾紙具有青霉素活性,在手術(shù)結(jié)束后第2 d給藥,模型組灌服等體積的生理鹽水,另一組小鼠灌服丹參提取液18 d。于最后一次給藥結(jié)束1 h后處死昆明小鼠,取出肩胛部皮下濾紙片,并取周邊少量肉芽組織,常規(guī)干燥處理后,使用天平稱量組織并計(jì)算增長肉芽組織重量,為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,測量數(shù)據(jù)應(yīng)統(tǒng)計(jì)3次以上[7]。

        1.5 統(tǒng)計(jì)分析

        本試驗(yàn)用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布的情況下,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 急性毒性試驗(yàn)(LD50)結(jié)果分析

        通過口服給藥后,各組小鼠在出現(xiàn)短暫安靜和卷縮身體后轉(zhuǎn)為正常,在最大給藥劑量為5 050 mg/kg時(shí),小鼠未出現(xiàn)死亡。根據(jù)毒性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)最大給藥劑量為5 000 mg/kg,為無毒物質(zhì),故可以證明丹參酮提取物無毒,可以應(yīng)用于臨床[8]。

        2.2 丹參酮提取物對(duì)小鼠耳腫脹的影響

        由表1可知,丹參酮提取物的抗炎實(shí)驗(yàn)表明每天腹腔注射425 mg/kg丹參酮提取物可以有效控制二甲苯誘導(dǎo)的昆明小鼠耳腫脹,與攝入生理鹽水的模型組相比,存在顯著差異(P<0.01);丹參酮提取物組昆明小鼠鼠耳腫脹的腫脹率高于氫化可的松組。

        表1 丹參酮提取物對(duì)昆明小鼠耳腫脹的影響

        2.3 丹參酮提取物對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

        由表2可知,丹參酮提取物組與模型組相比,存在顯著差異(P<0.01),表明對(duì)小鼠應(yīng)用丹參酮提取物可顯著減少染料的滲出量,且丹參酮組與氫化可的松組無顯著差異。

        表2 丹參酮提取物對(duì)昆明小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性影響

        2.4 丹參酮提取物對(duì)小鼠足跖腫脹及(PEG2)滲出影響

        丹參酮提取物對(duì)昆明小鼠足跖腫脹及(PEG2)滲出的試驗(yàn)結(jié)果表明,丹參酮提取物組與模型組相比,存在顯著差異(P<0.01),表明丹參酮提取物對(duì)發(fā)生炎癥足中PEG2的滲出有顯著抑制作用。丹參酮提取物組與氫化可的松組比較無顯著差異,均能有效地抑制PEG2的滲出。詳見表3。

        表3 丹參提取物對(duì)昆明小鼠足跖腫脹及PEG2滲出的影響

        2.5 丹參酮提取物對(duì)小鼠紙片肉芽腫的影響

        由表4可知,丹參酮提取物組與僅使用生理鹽水的模型組相比,具有顯著差異(P<0.01),表明丹參酮提取物在抗紙片引起的肉芽腫方面有明顯的效果。

        表4 丹參提取物對(duì)昆明小鼠紙片肉芽腫的影響

        3 結(jié)論

        由急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,丹參酮提取物為無毒物質(zhì),可以應(yīng)用于臨床;通過丹參酮提取物對(duì)小鼠耳腫脹的影響試驗(yàn)表明丹參酮提取物組昆明小鼠鼠耳腫脹的腫脹率高于氫化可的松組;通過丹參酮提取物對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響試驗(yàn)表明對(duì)小鼠應(yīng)用丹參酮提取物可顯著減少染料的滲出量,與氫化可的松無顯著差異;通過丹參酮提取物對(duì)小鼠足跖腫脹及前列腺素E2(PEG2)滲出影響表明丹參酮提取物與氫化可的松均能有效地抑制PEG2的滲出;通過以上試驗(yàn)結(jié)果表明丹參酮提取物對(duì)急性炎癥具有顯著的臨床效果;通過丹參酮提取物對(duì)小鼠紙片肉芽腫的影響表明丹參酮提取物在抗紙片引起的肉芽腫方面有明顯的效果,丹參酮提取液能有效減少肉芽組織增生,對(duì)慢性炎癥反應(yīng)亦有明顯的抗炎效果。以上試驗(yàn)結(jié)果顯示參酮提取物對(duì)急性以及慢性炎癥反應(yīng)皆有較好的抑制作用,能夠?yàn)檫M(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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