張燕娜，章郭真，李剛

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200438；2.上海濟(jì)煜醫(yī)藥科技有限公司，上海201203）

近年來，隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的迅速發(fā)展，動物細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白需求量急劇增加，中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）細(xì)胞已成為細(xì)胞表達(dá)單克隆抗體培養(yǎng)系統(tǒng)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。然而，人源化重組蛋白的加工只能通過哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，因此一個優(yōu)質(zhì)成功的細(xì)胞培養(yǎng)工藝對整個藥物開發(fā)過程顯得尤為重要[1]。為能滿足日益壯大的市場需求，大分子添加劑減少剪切損傷的使用，使懸浮培養(yǎng)得到廣泛應(yīng)用[2]。在懸浮培養(yǎng)中，為了滿足營養(yǎng)成分的需求，20世紀(jì)90年代后，流加培養(yǎng)開始受到更多學(xué)者的青睞[3]。細(xì)胞培養(yǎng)工藝的改進(jìn)和優(yōu)化為細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了助力。一個完整的工藝過程可以分為準(zhǔn)備階段（設(shè)備的準(zhǔn)備、清洗消毒、培養(yǎng)基的配制和過濾以及細(xì)胞種子的準(zhǔn)備、擴(kuò)增與檢測）、細(xì)胞培養(yǎng)階段（細(xì)胞接種、培養(yǎng)工藝參數(shù)設(shè)定、添加補(bǔ)料及其他添加物等）和產(chǎn)物收獲階段（培養(yǎng)上清液的預(yù)處理、蛋白測定及質(zhì)量分析等），根據(jù)不同細(xì)胞株的特點(diǎn)，實(shí)際開發(fā)中培養(yǎng)工藝各有不同。

在懸浮培養(yǎng)中，細(xì)胞在次優(yōu)的生長條件下會形成聚集，發(fā)生結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞代謝出現(xiàn)異常，乳酸堆積，細(xì)胞存活率降低，影響蛋白表達(dá)產(chǎn)量及質(zhì)量。對于細(xì)胞結(jié)團(tuán)的問題，有研究認(rèn)為結(jié)團(tuán)可能是由于脫氧核糖核酸（DNA）從死亡的細(xì)胞間釋放后，在細(xì)胞與細(xì)胞之間架橋引起的，若在培養(yǎng)基中添加脫氧核糖核酸酶I（DNase I）可以避免結(jié)團(tuán)現(xiàn)象的發(fā)生[4]。但是DEE等[5]則認(rèn)為通過添加肝素、硫酸葡聚糖及硫酸戊糖等高度磺化硫酸聚陰離子物質(zhì)，可成功解決BTITN5BI-4昆蟲細(xì)胞的結(jié)團(tuán)問題，使蛋白表達(dá)量顯著提高。同時也有研究表明，添加濃度為25 mg/L的硫酸葡聚糖（分子量為5 000 Da）能避免細(xì)胞的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，同時能提高最大細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量[6]。

細(xì)胞培養(yǎng)工藝的穩(wěn)健是細(xì)胞培養(yǎng)放大和生產(chǎn)的關(guān)鍵。本文添加的抗結(jié)團(tuán)劑為商業(yè)化產(chǎn)品，其主要成分是硫酸葡聚糖。在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中常會發(fā)生細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，當(dāng)發(fā)生黏附結(jié)團(tuán)時，聚集團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境會發(fā)生惡化，出現(xiàn)供氧不足、代謝廢物積累、營養(yǎng)物質(zhì)不足等問題，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。在實(shí)驗(yàn)中添加主要成分為帶負(fù)電荷的硫酸葡聚糖的抗結(jié)團(tuán)劑可以改變細(xì)胞表面的電荷，使細(xì)胞維持單細(xì)胞形態(tài)，從而改善其生存環(huán)境。然而，抗結(jié)團(tuán)劑在細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物純化過程中需要去除并測定殘留量，加上抗結(jié)團(tuán)劑價格昂貴，應(yīng)用抗結(jié)團(tuán)劑時除了要考慮工藝優(yōu)化，還要注意降低成本。因此，本文對在細(xì)胞培養(yǎng)不同階段添加抗結(jié)團(tuán)劑對細(xì)胞生長代謝、蛋白表達(dá)量及質(zhì)量的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用的CHO-S和CHO-K1細(xì)胞由上海濟(jì)煜生物科技有限公司提供。

Dynamis無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，美國Gibco公司；Cellboost7a/7b補(bǔ)料培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；抗結(jié)團(tuán)劑ACA，美國Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

（1）種子鏈階段：分別復(fù)蘇CHO-S和CHO-K1細(xì)胞各2支，一支添加ACA，一支不添加，置于125 mL搖瓶，并在120 r/min、36.5 ℃、5%CO2以及70%濕度的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至2～4 d，進(jìn)行一次傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)基及添加物與復(fù)蘇時保持一致。傳代擴(kuò)增四代，進(jìn)行流加培養(yǎng)階段接種。

（2）流加培養(yǎng)階段：將種子鏈傳代擴(kuò)增至第四代的細(xì)胞接種至3 L生物反應(yīng)器，初始培養(yǎng)體積1.2 L，pH控制在6.95±0.25，溶氧控制為40%，攪拌轉(zhuǎn)速為165 r/min。流加培養(yǎng)過程中通過補(bǔ)料補(bǔ)糖維持葡萄糖在0.5～7.0 g/L，每天取樣計(jì)數(shù)監(jiān)測細(xì)胞生長狀態(tài)及生化指標(biāo)。細(xì)胞培養(yǎng)至14 d，進(jìn)行蛋白濃度分析，并對收獲液進(jìn)行親和層析后，分析關(guān)鍵質(zhì)量。

1.3 儀器與設(shè)備

Vi-cell XR型細(xì)胞存活率分析儀，美國Beckman Coulter公司；Multitron型二氧化碳搖床，瑞士Infors公司；Bioprofile Flex2型生化分析儀，德國Nova Biomedical公司；TSGP10型恒溫水浴鍋，美國ThermoFisher公司；ABL90 Flex型血?dú)夥治鰞x，丹麥Radiometer公司；my-control型生物反應(yīng)器，荷蘭Applikon公司。

1.4 分析方法

活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率采用臺盼藍(lán)染色法。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動計(jì)數(shù)，血?dú)夥治鰞x檢測pH，生化分析儀檢測葡萄糖、乳酸和滲透壓。

抗體濃度采用HPLC-Protein A法檢測；抗體純度采用SEC-HPLC和CE-SDS分析；PI及電荷異構(gòu)體采用iCIEF法分析。

細(xì)胞倍增時間（DT）代表細(xì)胞翻一倍所需的時間，是衡量細(xì)胞生長快慢的指標(biāo)。DT按公式（1）計(jì)算。

式中：DT為倍增時間，h；t為培養(yǎng)時間，h；N0為接種后起始細(xì)胞數(shù)，個/mL；Nt為培養(yǎng)t時間后的細(xì)胞數(shù)，個/mL。

產(chǎn)物表達(dá)量Titer主要由單個細(xì)胞的產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（Qp）和累計(jì)活細(xì)胞密度（IVCD）共同決定。其中單個細(xì)胞的產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（Qp）代表細(xì)胞異源表達(dá)重組蛋白的能力。Qp和IVCD按公式（2）和公式（3）計(jì)算。

式中：Titer為產(chǎn)物表達(dá)量，g/L；Qp為單個細(xì)胞的產(chǎn)物比生產(chǎn)速率，pg/（個·d）；Dn和Dn-1分別為，；VCDn和VCDn-1分別為第n天和第n-1天活細(xì)胞密度，個/mL；IVCDn和IVCDn-1分別為第n天和第n-1天累計(jì)活細(xì)胞密度，個/mL；當(dāng)n=0時，IVCD=VCD。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism7軟件的t檢驗(yàn)分析添加和不添加ACA組細(xì)胞倍增時間之間是否存在顯著差異，P＜0.05表明有顯著性差異，反之差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子鏈階段

種子鏈細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞液從凍存管中復(fù)蘇，隨著細(xì)胞密度的增長和活率的恢復(fù)，每隔2～3天換液擴(kuò)增，直至達(dá)到接種生物反應(yīng)器的需求量。種子鏈過程中細(xì)胞的密度一定程度上影響細(xì)胞擴(kuò)增的代次，細(xì)胞的活率反映細(xì)胞的存活狀況。

圖1（a）為CHO-K1細(xì)胞在種子鏈階段的生長狀況。添加ACA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度明顯高于不添加ACA對照組。如表1所示，添加ACA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時間變化較小，隨著細(xì)胞恢復(fù)和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞倍增時間也在縮短，從復(fù)蘇代P1的24.80 h縮短至P5的21.90 h。在沒有添加ACA的對照組中，細(xì)胞倍增時間變化較為明顯，隨著細(xì)胞恢復(fù)和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞倍增時間大體上也在縮短，從復(fù)蘇代P1的33.64 h縮短至P5的22.47 h。隨培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)的增加，兩個組別差距在縮小，但添加ACA組的生長仍然優(yōu)于不添加組。

圖1 種子鏈細(xì)胞密度及活率

表1 種子鏈細(xì)胞倍增時間（單位：h）

圖1（b）為CHO-S細(xì)胞在種子鏈階段的生長狀況。在不添加ACA培養(yǎng)的搖瓶中，通氣攪拌以及pH等無法精確控制，加之CHO-S細(xì)胞本身的結(jié)團(tuán)特性，培養(yǎng)中不添加ACA的對照組細(xì)胞有肉眼可見的細(xì)胞碎片，且細(xì)胞生長密度明顯較低，細(xì)胞活率略低。由表1可知，不添加ACA組的倍增時間相對于添加ACA的實(shí)驗(yàn)組明顯較長。對于添加ACA細(xì)胞，從復(fù)蘇開始，倍增時間變化較小，隨著細(xì)胞恢復(fù)和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞倍增時間也在縮短，從復(fù)蘇代P1的21.86 h縮短至P5的17.46 h。在沒有添加ACA的培養(yǎng)組中，細(xì)胞倍增時間變化較為明顯，隨著細(xì)胞恢復(fù)和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞倍增時間明顯縮短，從復(fù)蘇代P1的39.34 h縮短至P5的20.68 h。種子鏈階段添加ACA能明顯改善CHO-S細(xì)胞的生長狀態(tài)，使其處于較優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境中。

對CHO-S和CHO-K1細(xì)胞的倍增時間做t檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)CHO-S細(xì)胞種子鏈兩個組細(xì)胞有顯著差異（P＜0.05）；CHO-K1細(xì)胞種子鏈兩個組細(xì)胞在t檢驗(yàn)分析中雖有差異，但不顯著。在工藝開發(fā)過程中，種子鏈階段細(xì)胞的生長狀況直接影響細(xì)胞種子鏈擴(kuò)增的代數(shù)和培養(yǎng)周期，也會間接影響流加階段細(xì)胞的穩(wěn)定代謝，而ACA的添加對種子鏈細(xì)胞培養(yǎng)有積極作用。

2.2 流加階段

2.2.1 流加階段細(xì)胞生長及代謝

流加培養(yǎng)能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度，避免有些營養(yǎng)成分在初始階段濃度過高而影響細(xì)胞的生長代謝以及產(chǎn)物的形成，也能防止某些限制性營養(yǎng)成分在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中被耗盡而影響細(xì)胞的生長代謝以及產(chǎn)物的形成。本實(shí)驗(yàn)采用種子鏈添加ACA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行流加培養(yǎng)階段接種。流加培養(yǎng)在細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期開始對細(xì)胞進(jìn)行流加補(bǔ)料培養(yǎng)，控制葡萄糖濃度在0.5～7.0 g/L。

圖2為CHO-K1細(xì)胞在流加培養(yǎng)階段細(xì)胞生長和代謝狀況。兩個組別細(xì)胞均在第2天進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞快速生長。在第5～7天處于平臺期，細(xì)胞密度及活率處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)。第8天開始，由于培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)成分、細(xì)胞代謝廢物以及培養(yǎng)時間的影響，細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度開始下降。整個培養(yǎng)過程中，pH維持在無控制作用區(qū)（6.95±0.25），乳酸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。生長代謝方面，兩個組別細(xì)胞表現(xiàn)出高度的一致性。

圖2 CHO-K1細(xì)胞流加培養(yǎng)生長代謝

如圖3所示，CHO-S細(xì)胞在流加培養(yǎng)階段添加ACA，代謝出現(xiàn)異常，在培養(yǎng)至第6天時，細(xì)胞活率明顯下降，乳酸代謝從消耗轉(zhuǎn)為再次生產(chǎn)，并不斷累積，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液pH下降，滲透壓上升。流加階段未添加ACA組細(xì)胞生長正常，培養(yǎng)至第14天時收獲。整個培養(yǎng)過程中滲透壓隨培養(yǎng)時間和補(bǔ)料的添加逐漸增加，乳酸呈現(xiàn)先生成再下降最后有再次生成的趨勢，收獲時乳酸為1.05 g/L，在可接受范圍內(nèi)；pH在無控制作用區(qū)（6.95±0.25）。

圖3 CHO-S細(xì)胞流加培養(yǎng)生長代謝

2.2.2 流加階段細(xì)胞產(chǎn)物生成

生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞流加培養(yǎng)，控制溶氧在40%、攪拌速度為265 r/min、pH無控制作用區(qū)為6.95±0.25以及0.1 m3/（m3·min）的恒定通氣速率。培養(yǎng)過程中，監(jiān)測細(xì)胞的生長代謝狀況，定量流加補(bǔ)料，以滿足細(xì)胞生長的營養(yǎng)需求[7]。

表2為流加培養(yǎng)結(jié)束時蛋白的表達(dá)量、單個細(xì)胞的蛋白比生產(chǎn)速率和累計(jì)活細(xì)胞密度。在CHO-K1細(xì)胞中，兩個組別的蛋白表達(dá)量均大于7 g/L，且相差不大。單個細(xì)胞產(chǎn)蛋白的能力接近，Qp均在29 pg/（個·d）。兩個組別細(xì)胞活細(xì)胞密度生長趨勢具有一致性，累計(jì)活細(xì)胞密度差異不大。由于表達(dá)系統(tǒng)的區(qū)別，添加ACA的CHO-S細(xì)胞代謝異常，終止培養(yǎng)；沒有添加ACA組的細(xì)胞最終蛋白產(chǎn)量為3.20 g/L，Qp為12.76 pg/（個·d），能夠滿足工藝要求。

表2 流加培養(yǎng)蛋白表達(dá)和累計(jì)活細(xì)胞密度

2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物質(zhì)量

抗體類藥物屬于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，在細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化以及保存運(yùn)輸?shù)冗^程中容易發(fā)生不均一性變化，如C末端氨基酸發(fā)生突變，形成二聚體和多聚體等結(jié)構(gòu)變異，而這些變異會嚴(yán)重影響藥物的臨床效果和安全性能。而在流加培養(yǎng)中，有毒物質(zhì)和代謝廢物的積累對目的蛋白的質(zhì)量有不利影響[8]。本實(shí)驗(yàn)中主要通過SEC-HPLC、iCIEF、CE-SDS分析檢測蛋白的質(zhì)量，其中SEC-HPLC和CE-SDS都是分析產(chǎn)品純度和雜質(zhì)的重要方法，SEC-HPLC側(cè)重聚體分析，CE-SDS側(cè)重片段分析。iCIEF主要用于分析產(chǎn)品的等電點(diǎn)和電荷異質(zhì)性。而細(xì)胞培養(yǎng)工藝條件對抗體異質(zhì)性的影響非常顯著[9]。

由表3可知，在CHO-K1細(xì)胞中，兩個組別SEC單體純度均大于97%、iCIEF主峰均大于73%、CE-SDS主峰大于92%，添加ACA對蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量沒有明顯的影響，兩個組別蛋白質(zhì)量高度一致。在CHO-S細(xì)胞中，iCIEF主峰較低，堿性峰較大，這是由于CHO-S表達(dá)系統(tǒng)，C端賴氨酸變體的存在。

表3 細(xì)胞流加培養(yǎng)蛋白質(zhì)量

3 結(jié)論

抗結(jié)團(tuán)劑的添加可以改變細(xì)胞表面的電荷，使細(xì)胞呈現(xiàn)單細(xì)胞狀態(tài)，從而改善細(xì)胞的生存微環(huán)境。CHO-K1和CHO-S細(xì)胞在種子鏈階段添加ACA均能改善種子細(xì)胞狀態(tài)，促進(jìn)種子生長速度，縮短其倍增時間。對于CHO-K1細(xì)胞，添加和不添加ACA組在細(xì)胞生長、細(xì)胞代謝、蛋白表達(dá)量以及質(zhì)量方面均沒有明顯差異。CHO-S細(xì)胞流加培養(yǎng)階段添加ACA會出現(xiàn)代謝異常，如乳酸異常堆積、pH下降、細(xì)胞活率迅速下降，因此提前終止培養(yǎng)；CHO-S細(xì)胞流加培養(yǎng)階段不添加ACA時，細(xì)胞生長、細(xì)胞代謝、蛋白表達(dá)量及蛋白質(zhì)量均正常，符合預(yù)期。結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)代謝的穩(wěn)定性、工藝的復(fù)雜度以及后續(xù)放大成本考慮[10-11]，CHO-K1和CHO-S細(xì)胞培養(yǎng)中，只需在其種子鏈擴(kuò)種期間添加ACA以改善種子生長狀態(tài)。