郭克兵，田湞楨，付艷紅，嚴(yán)琬瑩，季金茍

（重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

人發(fā)、羊毛、兔毛、雞毛等角蛋白含量豐富，是開發(fā)嚴(yán)重不足的蛋白質(zhì)來源之一。近年來，隨著對角蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)不同種屬動物來源的角蛋白由于組分的區(qū)別，可以產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[1]。其中，人發(fā)角蛋白由于其是人源性的，具有免疫學(xué)方面的優(yōu)勢[2]，在植入材料方面具有極大的應(yīng)用潛力，受到了越來越多的關(guān)注。

將人發(fā)、羊毛等天然角蛋白材料解聚為線性角蛋白大分子，是制備再生角蛋白材料的前提[3]。人發(fā)中的角蛋白是以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)的α-角蛋白，是由氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華力和二硫鍵來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的水不溶性大分子[4-6]，難以提取，如何從人發(fā)中高效提取并純化角蛋白是當(dāng)前學(xué)者們普遍關(guān)注的問題。目前從人發(fā)中提取角蛋白的方法有兩種，一種是“Shindai法”，另一種是“還原法”[7-8]。這兩種方法均使用有毒的β-巰基乙醇，且提取時間較長。房啟海等[9]用熔融尿素法對羊毛角蛋白進(jìn)行了提取，提取時間在50 min左右，作者認(rèn)為熔融尿素法之所以可以較快地對羊毛角蛋白進(jìn)行提取，是高溫下尿素分解產(chǎn)生氨氣，進(jìn)入角蛋白結(jié)晶區(qū)，破壞羊毛角蛋白之間的氫鍵。

高溫水通常是指溫度在100 ℃到臨界點(diǎn)附近，以及超臨界狀態(tài)時的壓縮水。隨著溫度升高，高溫水密度減小，氫鍵變?nèi)酰镔|(zhì)的溶解度增大，這有利于反應(yīng)物處于同一反應(yīng)相中，降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速率[10-11]。因此，本文擬利用高溫水能增大物質(zhì)的溶解度，且氨氣有助于破壞角蛋白之間的氫鍵等原理提取人發(fā)角蛋白，以期得到一種提取時間短、對蛋白質(zhì)破壞小的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人發(fā)，搜集于理發(fā)店；聚氧乙烯辛基苯酚醚-10（OP-10），成都科龍化工試劑廠；氫氧化鈉、23%氨水、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris），重慶川東化工有限公司；碳酸氫鈉，成都市科隆化學(xué)品有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R250、過硫酸銨，上海生工生物工程股份有限公司；醋酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上所有試劑均為分析純。蛋白上樣緩沖液、彩色預(yù)染Marker（11～180 kD），生物試劑，上海源葉生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。

GFK-10-200型水熱合成反應(yīng)釜，上海貝倫儀器設(shè)備有限公司；DHG-9033A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，沙鷹科學(xué)儀器有限公司；MD1444（8 000～14 000 Da）型透析袋，上海源葉生物科技有限公司；GL-21M型高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FD-IA-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器；Nicolet iS50型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司；1658001型電泳儀設(shè)備，美國Bio-Rad公司；PANalytical X’Pert Powder X射線衍射儀，Spectris公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人發(fā)預(yù)處理

按文獻(xiàn)[6,12]的方法，稱取一定量人發(fā)，剪至0.5～1.0 cm，按1∶2∶2（g∶mL∶mL）的比例向燒杯中依次加入人發(fā)、4% OP-10和5% NaOH，使人發(fā)浸沒于溶液中，室溫下攪拌2 h。用去離子水沖洗6次，將其置于60 ℃烘箱過夜干燥，保存待用。

1.2.2 高溫水氨解

稱取2.0 g已預(yù)處理的人發(fā)，置于200 mL水熱合成反應(yīng)釜內(nèi)膽，加入氨水，攪拌均勻，將反應(yīng)釜放入烘箱，在一定溫度下反應(yīng)一段時間。高溫水氨解結(jié)束后，在人發(fā)反應(yīng)液中加入50 mL去離子水，室溫下攪拌1.5 h，用四號篩網(wǎng)過濾，收集濾液，濾渣干燥稱重。按照式（1）計(jì)算人發(fā)角蛋白溶解率（S）：

式中，m0為反應(yīng)前的人發(fā)重量，g；m1為水提取后的干燥濾渣重量，g。

單因素條件優(yōu)化設(shè)置如下。（1）溫度：氨水用量10 mL，反應(yīng)時間30 min，反應(yīng)溫度分別設(shè)置為175 ℃、180 ℃、185 ℃和190 ℃。（2）氨水用量：反應(yīng)溫度185 ℃，反應(yīng)時間30 min，選擇氨水添加量分別為6 mL、8 mL、10 mL和12 mL。（3）時間：反應(yīng)溫度185℃，氨水用量8 mL，考察反應(yīng)27 min、30 min、33 min和36 min對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.2.3 透析

將收集的濾液調(diào)至pH=7.4，靜置后在4 ℃下12 000×g離心20 min，合并上清液。上清液調(diào)pH至4.0～4.2，在4 ℃下6 000×g離心20 min。取角蛋白沉淀分散于1 mol/L碳酸氫鈉中，放入透析袋（截留分子量3 500 Da）中透析36 h，透析外液為去離子水，每12 h更換一次透析外液。冷凍干燥，得淺黃色粉末。按照式（2）計(jì)算人發(fā)角蛋白產(chǎn)率（P）：

式中，m0為反應(yīng)前的人發(fā)重量，g；m2為凍干后角蛋白粉末的重量，g。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參照RAMYA等[13]方法并稍作修改。配置12%的分離膠：1.6 mL去離子水、2 mL丙烯酰胺溶液（30%）、1.3 mL的 Tris（pH 8.8，1.5 mol/L）、0.05 mL的SDS溶液（10%）、0.05 mL過硫酸銨（10%）和0.002 mL四甲基乙二胺。5%濃縮膠：2.1 mL去離子水、0.5 mL丙烯酰胺混合溶液（30%）、0.38 mL的Tris（pH 6.8，1.0 mol/L）、0.03 mL的SDS溶液（10%）、0.03 mL過硫酸銨（10%）和0.003 mL四甲基乙二胺。

取20 μL角蛋白樣品（15 mg/mL）加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min。取煮沸冷卻后的樣品10 μL和Marker 5 μL，上樣。80 V電壓下進(jìn)行電泳，待Marker條帶出現(xiàn)后，增大電壓至110 V，直至電泳分離結(jié)束?？捡R斯亮藍(lán)R250染色，乙醇-醋酸脫色至無背景色。

1.2.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）

將溴化鉀在紅外燈下于研缽中研磨成均勻粉末，再將角蛋白樣品與溴化鉀以1∶100的比例混合均勻后，研磨成粉。壓片機(jī)20 MPa壓制1～2 min成透明薄片，用FT-IR在4 000～400 cm-1掃描。

1.2.6 粉末X射線衍射（XRD）

取適量角蛋白樣品，研磨成細(xì)粉，過200目篩，進(jìn)行粉末X射線衍射測試。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad軟件（Insight Science公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平設(shè)為α=0.05；用最小顯著性差異法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異顯著性，用P＜0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫水氨解條件的優(yōu)化

2.1.1 溫度

從圖1可以看出，溫度從175 ℃升高到185 ℃，角蛋白溶解率和產(chǎn)率均逐漸增加；溫度升高到190 ℃時溶解率繼續(xù)增大，但產(chǎn)率反而減少。正常人的毛發(fā)主要由表皮層、皮質(zhì)層和髓質(zhì)層組成[14]。表皮存在6～12層毛鱗片，像魚鱗一樣硬質(zhì)透明；皮質(zhì)層由蛋白細(xì)胞和色素細(xì)胞組成，占頭發(fā)的80%左右，是頭發(fā)的主體。當(dāng)溫度較低時，毛鱗片對抗氨解能力較強(qiáng)，所以在175 ℃時，角蛋白溶解率和產(chǎn)率都較小，升高溫度使角蛋白溶解率和產(chǎn)率增大，但當(dāng)溫度超過185 ℃時，角蛋白被進(jìn)一步降解成小分子量蛋白，從而穿過透析袋進(jìn)入透析外液，使產(chǎn)率降低。

圖1 溫度對溶解率和產(chǎn)率的影響

從圖2可以看出，175～185 ℃時分子量主要分布在25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa；190 ℃時凝膠色帶不明顯。可見在高溫氨解體系中，溫度控制在185 ℃較為適宜。

圖2 溫度對分子量分布影響

2.1.2 氨水用量

從圖3可以看出，氨水用量為8 mL時產(chǎn)率相對最大。角蛋白產(chǎn)率先增加后下降，是由于隨著氨水用量增加，反應(yīng)釜內(nèi)壓力增加，氨氣和高溫水的各種理化性質(zhì)均發(fā)生了相應(yīng)的改變，有利于角蛋白提取率增加，但壓力過大可能使角蛋白的分子鏈降解速率加快，使角蛋白的提取率下降，故氨水用量控制在8 mL比較適宜。從圖4可以看出，分子量主要分布于25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa。

圖3 氨水用量對溶解率和產(chǎn)率的影響

圖4 氨水用量對分子量分布影響

2.1.3 時間

從圖5可以看出，隨著時間的增加，溶解率逐漸增加，產(chǎn)率先增加后下降，至33 min時產(chǎn)率最高，可能是時間過長導(dǎo)致降解過度。從圖6可以看出，盡管降解33 min時產(chǎn)率最高，但其分子量主要分布在25 kDa以下，角蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞較大，降解30 min時，角蛋白分子量主要分布在25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa，產(chǎn)率為28.33%。一般認(rèn)為高分子量的角蛋白在制備現(xiàn)代生物材料過程中具有顯著優(yōu)勢[3]，因此氨解30 min較適宜。

圖5 時間對溶解率和產(chǎn)率的影響

圖6 時間對分子量分布影響

2.2 角蛋白的FT-IR分析

從圖7可以看出，天然人發(fā)纖維與提取的人發(fā)角蛋白均具有3 200～3 400 cm-1肽鍵酰胺A帶，1 638～1 657 cm-1的酰胺I帶，1 534～1 545 cm-1的酰胺Ⅱ帶和1 240～1 245 cm-1的酰胺Ⅲ帶，說明兩者均具有典型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[15-16]，提取所得角蛋白與天然人發(fā)纖維分子結(jié)構(gòu)相同。

圖7 人發(fā)纖維（a）與角蛋白提取物（b）的紅外譜圖

人發(fā)纖維在2 364 cm-1左右沒有明顯的巰基吸收峰，而在提取的人發(fā)角蛋白出現(xiàn)此吸收峰，表示反應(yīng)后巰基增多；和天然人發(fā)纖維相比，提取的人發(fā)角蛋白中酰胺A帶從3 285 cm-1紅移到3 365 cm-1，且吸收程度增大、譜帶變寬，推測是高溫產(chǎn)生的氨氣進(jìn)入角蛋白結(jié)晶區(qū)，破壞酰胺氫鍵所致[9]；另外，高溫和氨水的堿性也易使二硫鍵、酰胺氫鍵等斷裂或減弱，使A帶吸收程度增大、譜帶變寬。在提取的人發(fā)角蛋白中，酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶的吸收強(qiáng)度相差較大，根據(jù)峰的歸屬可知，酰胺I帶為νC=O伸縮振動，酰胺Ⅱ帶為νN-H伸縮振動及δN-H彎曲振動，因?yàn)镃=O鍵和N-H鍵都受角蛋白中的酰胺氫鍵嚴(yán)重影響，可見，高溫氨解對νC=O伸縮振動的吸收程度影響更大。反應(yīng)前后的峰圖中沒有明顯雜峰，可初步判斷提取過程中基本未引入雜質(zhì)。

2.3 角蛋白的XRD分析

圖8為角蛋白提取物和人發(fā)纖維的XRD圖譜。角蛋白在9°和20°左右存在兩個特征峰，9°的峰（結(jié)晶Ⅰ區(qū)）歸屬于α-螺旋和β-折疊，20°左右的峰（結(jié)晶Ⅱ區(qū)）則歸屬于β-折疊[17]。與人發(fā)纖維相比，角蛋白提取物9°的峰不明顯，20°左右對應(yīng)的峰弱化，表明晶體化程度降低，提取過程破壞了角蛋白二級結(jié)構(gòu)中部分α-螺旋和β-折疊。

圖8 人發(fā)纖維（a）與角蛋白提取物（b）的X射線衍射圖

3 結(jié)論

本文采用高溫水氨解的方法對人發(fā)角蛋白進(jìn)行了提取，結(jié)果表明，在185 ℃、8 mL氨水、降解30 min條件下，可獲得分子量分布在25 kDa以下、35～48 kDa和75～135 kDa的角蛋白，分子量破壞較小。XRD顯示，所得角蛋白晶體化程度降低，提取過程破壞了人發(fā)角蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊；FT-IR可以看出，提取所得角蛋白具有典型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，且與天然人發(fā)纖維分子結(jié)構(gòu)相同，提取時氨氣進(jìn)入角蛋白結(jié)晶區(qū)，破壞酰胺氫鍵，二硫鍵斷裂或減弱，使提取時間大大加快。研究表明，高溫水氨解是一種快速提取人發(fā)角蛋白的較好方法。