吳靜

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

龍腦樟[Cinnamomum camphora(L.) Presl]為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，1987年首次在江西吉安發(fā)現(xiàn)，目前在江西吉安、湖南新晃兩地有種植，資源較為稀缺[1]。因其精油中富含右旋龍腦（天然冰片），在中醫(yī)典籍中將其劃分為芳香開竅類藥材，常用于通竅明目、解郁散火、祛風(fēng)和中[2-8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冰片具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、增加血-腦脊液屏障及血腦屏障通透性、抗腦缺血、雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等功能[9]，因此常用于冠心病、動脈粥樣硬化及心血管阻塞等心血管疾病的治療。此外，研究表明龍腦樟中含有苯丙素類、萜類及黃酮類化合物等活性成分[10]。黃酮類化合物不能在人體內(nèi)直接合成，廣泛存在于自然界的植物中，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，是一種天然的活性成分，具有抗菌殺蟲、延緩衰老、緩解動脈粥樣硬化、降血脂、降血壓等功能[11-13]。本文針對龍腦樟黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步提高龍腦樟資源的整體利用率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海盈元化工有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑股份有限公司。

龍腦樟由江西樟鄉(xiāng)天然冰片有限責(zé)任公司提供，經(jīng)江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所李雄輝研究員鑒定為龍腦樟，樣本編號為PML202102。

1.2 儀器

2500A多功能粉碎機，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DLSB-10L/10低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；ME204E電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，避光反應(yīng)5 min，之后依次加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液、2 mL 4%氫氧化鈉溶液，靜置反應(yīng)15 min。于510 nm處測定吸光度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 龍腦樟黃酮提取

1.3.2.1 工藝流程

黃酮提取流程為樣品→干燥粉碎（過20目篩）→石油醚脫脂→回收石油醚→乙醇超聲提取→抽濾→濃縮→定容→龍腦樟黃酮提取液。

1.3.2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取1.00 g龍腦樟粉末，按1∶20（g∶mL）加入石油醚（60～90 ℃沸程），于50 ℃超聲提取2次，超聲功率500 W，每次30 min，去上清液。殘渣于60 ℃烘箱中烘干。按照一定液料比加入乙醇溶液，超聲波提取，重復(fù)提取3次，抽濾，合并濾液，真空減壓濃縮，回收乙醇，定容至50 mL，獲得龍腦樟黃酮提取原液。參照標(biāo)準(zhǔn)品顯色方法，每組重復(fù)3次。按照公式（1）計算總黃酮提取量：

式中，P為待測樣品黃酮提取量（以蘆丁計），mg/g；C為代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到的提取物樣液的黃酮濃度，mg/mL；V為提取物樣液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為待測樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素實驗

稱取1.00 g干燥至恒重的龍腦樟粉末，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑量和提取溫度對總黃酮提取量的影響。按方法1.3.2.2測其黃酮提取量，每組平行提取3次，獲得各條件下最佳提取工藝條件。

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)。固定溶劑量為20 mL/g，提取溫度為50 ℃，提取時間為30 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%和70%對樣品黃酮提取量的影響。

（2）提取時間。固定溶劑量為20 mL/g，提取溫度為50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，考察提取時間分別為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min對樣品黃酮提取量的影響。

（3）溶劑量。固定提取溫度為50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時間為30 min，考察溶劑量分別為10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g 和 50 mL/g 對樣品黃酮提取量的影響。

（4）提取溫度。固定溶劑量為20 mL/g，提取時間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，考察提取溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃對樣品黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

依據(jù)單因素實驗確定的最佳工藝條件，針對（A）提取溫度、（B）提取時間、（C）溶劑量和（D）乙醇體積分?jǐn)?shù)，設(shè)計4因素3水平實驗，見表1。以黃酮提取量為響應(yīng)值，通過數(shù)據(jù)分析獲取最佳提取工藝條件。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁濃度（X）和吸光度（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.827 5X+0.311 1（R2=0.996 4），在0.06～0.60 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溶劑量

如圖1所示，龍腦樟黃酮提取量隨著溶劑體積增加呈上升趨勢，這說明溶劑較多時，龍腦樟粉末與溶劑充分接觸，在超聲波輔助作用下黃酮類物質(zhì)充分轉(zhuǎn)移至溶劑。而溶劑量達(dá)到40 mL/g后，溶劑繼續(xù)增加會使溶液中黃酮類物質(zhì)含量下降，這可能是因為溶劑已經(jīng)飽和，同時溶劑過多會使油脂類、糖類等黏性物質(zhì)滲出，進(jìn)一步影響溶液吸光度[14-15]。因此，確定40 mL/g為最佳溶劑量。

圖1 不同溶劑量對黃酮提取量的影響

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

如圖2所示，龍腦樟黃酮提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)不超過60%時隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，這可能是因為黃酮類化合物易溶于強極性溶劑。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時，總黃酮提取量減小，可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，使龍腦樟中色素、脂溶性物質(zhì)等滲出，黃酮類化合物溶解度降低[16]。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取量的影響

2.2.3 超聲時間

由圖3可知，龍腦樟黃酮提取量在超聲時間10～20 min內(nèi)隨時間延長呈上升趨勢，主要是因為超聲波的機械振動、擊碎和攪拌等功能，物質(zhì)分子運動加快，細(xì)胞壁破裂，黃酮類物質(zhì)與溶劑充分接觸并溶解。超聲時間超過20 min后，龍腦樟黃酮含量開始出現(xiàn)下降趨勢，這主要是由于超聲時間過長，植物細(xì)胞破碎，溶液黏度增加，擴(kuò)散速率降低，影響黃酮類物質(zhì)提取，同時超聲處理時間延長使黃酮類化合物穩(wěn)定性降低，黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞、分解[17]。因此，20 min為最佳超聲時間。

圖3 不同提取時間對黃酮提取量的影響

2.2.4 提取溫度

如圖4所示，提取溫度30～50 ℃，總黃酮提取量隨溫度升高而增加，是因為溫度升高導(dǎo)致分子熱運動速度加快，黃酮類物質(zhì)快速溶于溶劑中。提取溫度達(dá)到50 ℃時，龍腦樟黃酮類化合物幾乎完全浸出，溶劑達(dá)到飽和狀態(tài)，溫度繼續(xù)升高無法溶解出更多黃酮類化合物；同時高溫會破壞黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性，伴有大量的雜質(zhì)溶出，黃酮提取量下降。因此，最佳提取溫度為50 ℃。

圖4 不同提取溫度對黃酮提取量的影響

2.3 響應(yīng)面實驗

2.3.1 建立多元二次模型方程

4因素3水平Box-Behnken實驗數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，得到以龍腦樟黃酮提取量為響應(yīng)值的多元回歸方程（2）：

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)結(jié)果

式中，Y為總黃酮含量，mg/g；A為提取溫度，℃；B為超聲時間，min；C為溶劑量，mL/g；D為乙醇體積分?jǐn)?shù)，%。

模型方差分析結(jié)果見表3，模型P=0.019 8＜0.05，表明該實驗方法的實驗結(jié)果可信；失擬項P=0.872 2＞0.05，表明可用該數(shù)學(xué)模型推測試驗結(jié)果；R2adj=0.918 6表明有91.86%的情況可以用此方程解釋。A、AB、BD和A2對黃酮提取量的影響顯著（P＜0.05），D和D2對黃酮提取量的影響極顯著（P＜0.01），而B、C、AC、AD、BC、CD、B2和C2的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸方程模型的方差分析

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析

如圖6所示，提取溫度和超聲時間的交互作用顯著。將溶劑量和乙醇體積分?jǐn)?shù)固定在0水平，提取溫度不斷升高，黃酮提取量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，當(dāng)提取溫度達(dá)到57 ℃時，黃酮提取量達(dá)到最高。而對于超聲時間，分三段討論：提取溫度在40～50 ℃時，超聲時間越長，黃酮提取量越高；提取溫度在50～55 ℃時，超聲時間延長，黃酮提取量先增加后減少；提取溫度在55～60 ℃時，超聲時間越長，黃酮提取量減小。

圖6 提取溫度和超聲時間交互作用對黃酮提取量的影響

由圖7可知，提取溫度和溶劑量交互作用對龍腦樟黃酮提取量的影響不顯著。將超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)固定在0水平，黃酮提取量隨溫度的升高先增大后減小，黃酮提取量最大時，提取溫度為54 ℃。隨著單位物料加入溶劑體積的增加，黃酮提取量先增加后減小，溶劑體積達(dá)到45 mL/g時，龍腦樟黃酮提取量最大。

圖7 提取溫度和溶劑量交互作用對黃酮提取量的影響

如圖8所示，提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對黃酮提取量的影響不顯著。將超聲時間和溶劑量固定在0水平，提取溫度升高，龍腦樟黃酮提取量先增加后減小，提取溫度54 ℃時，黃酮提取量達(dá)到最高值。乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮提取量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到58%時，黃酮提取量最大。

圖8 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對黃酮提取量的影響

觀察圖9可知，超聲時間與溶劑量交互作用對黃酮提取量影響不顯著。將提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)定在0水平，可以得出，隨著超聲時間的延長和溶劑量的增加，黃酮提取量均表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢。超聲時間為21 min，溶劑量為41 mL/g，黃酮提取量最大。

圖9 超聲時間和溶劑量交互作用對黃酮提取量的影響

由圖10可知，超聲時間和溶劑量對黃酮提取量影響顯著。當(dāng)提取溫度和溶劑量處在0水平時，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～53%，隨著超聲時間延長，龍腦樟黃酮提取量不斷減??；而乙醇體積分?jǐn)?shù)在62%～70%，隨著超聲時間延長，黃酮提取量先增大后減小。超聲時間在15～19 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，黃酮提取量先增大后減??；超聲時間在19～35 min，龍腦樟黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而不斷減小。

圖10 超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對黃酮提取量的影響

如圖11所示，溶劑量與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對黃酮提取量的影響不顯著。將提取溫度和超聲時間固定在0水平，隨著溶劑量的不斷增大，龍腦樟黃酮提取量先增大后減小，當(dāng)黃酮提取量最大時，溶劑量為42 mL/g。乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，黃酮提取量也呈先增大后減小趨勢，黃酮提取量最大時，乙醇體積分?jǐn)?shù)為58%。

圖11 溶劑量和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對黃酮提取量的影響

綜合圖6～圖11結(jié)果可知，提取溫度與超聲提取時間，超聲提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對龍腦樟黃酮提取量影響顯著，觀察曲面圖的陡峭程度并結(jié)合P值，4個因素對龍腦樟黃酮提取量的影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞溶劑量＞超聲時間。

2.3.3 回歸模型驗證

綜上所述，得出的最佳提取條件為提取溫度60.00 ℃，超聲提取時間15.00 min，溶劑量45.84 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)50.03%。設(shè)計驗證實驗的條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溶劑量46 mL/g，超聲提取時間15 min，提取溫度60 ℃，重復(fù)提取3次，黃酮提取量分別為160.82 mg/g、161.23 mg/g、160.75 mg/g， 均 值 為160.93 mg/g。系統(tǒng)得出的理論值為161.86 mg/g，實驗值接近理論值，該模型可較好地預(yù)測龍腦樟黃酮類物質(zhì)的提取情況。

3 結(jié)論

本研究以乙醇為溶劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取龍腦樟黃酮工藝。龍腦樟黃酮最優(yōu)提取條件為提取溫度60 ℃、超聲提取時間15 min、溶劑量46 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，預(yù)測黃酮提取量為161.86 mg/g。經(jīng)實驗驗證，得出的實際黃酮提取量平均值為160.93 mg/g，與預(yù)測值相符，表明該提取條件可行。本研究可為龍腦樟黃酮類物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論支持，進(jìn)一步提高龍腦樟的綜合利用價值。