薛超，劉東璞,2，盛延良,2，呂婷，盧鳳美,2*

（1.佳木斯大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室，黑龍江佳木斯 154000）

近年來，過敏性疾病發(fā)病率明顯增高，已成為嚴重影響人們身體健康和生活質(zhì)量的全球性疾病。流行病學調(diào)查資料表明，目前我國的過敏性疾病發(fā)病率有不斷上升的趨勢[1-2]。由于過敏性猝死發(fā)病急驟，難以預(yù)見，極易引起醫(yī)療糾紛等一系列法律問題[3]。因此，與過敏反應(yīng)有關(guān)的死亡引起了法醫(yī)學家尤其是法醫(yī)病理學家關(guān)注[4]。當前過敏性疾病死亡的法醫(yī)學診斷仍是在排除其他疾病的基礎(chǔ)上結(jié)合死者的病史、組織病理學觀察和生物化學指標檢測等做出診斷。因此，找到過敏性疾病死亡的特異性診斷指標成為了近年來法醫(yī)學的熱門研究方向。

HK-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型神經(jīng)肽，屬于速激肽家族。HK-1的相關(guān)作用首先在B淋巴細胞內(nèi)得到證實[5]。而典型的速激肽受體有NI1R、NK2R和NK3R，研究表明HK-1明顯偏好于NK1R[6]。在哺乳動物中，速激肽家族廣泛分布在各種組織和體液中，包括肺臟和胃腸組織的間質(zhì)成分中[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在重度過敏性疾病的肥大細胞脫顆粒通路中存在一個HK-1/NK1R自分泌通路，可達到增強致敏持續(xù)性的效果，和嚴重的過敏性休克及猝死關(guān)系密切[8]。

為了探究HK-1在過敏性猝死中的表達及表達穩(wěn)定性、分析不同保存環(huán)境對尸體中相關(guān)指標的干擾程度，在卵蛋白（Ovalbumin，OVA）致大鼠過敏性猝死模型的基礎(chǔ)上，對各指標進行ELISA和qRTPCR檢測，以期在蛋白表達方面和mRNA表達方面對HK-1的表達進行全面系統(tǒng)的檢測，為過敏性疾病的法醫(yī)學診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立

健康SD雄性大鼠50只（由佳木斯大學動物實驗中心提供），體質(zhì)量（250±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為實驗組和對照組，實驗組40只，對照組10只。實驗組再次隨機分為0 h死亡組（10只）、24 h常溫組（10只）、48 h冷藏組（10只）、7 d冷凍組（10只）[9]。

實驗組按體重給予過敏原，每100 g體重給予10 mg卵蛋白（溶于0.5 mL生理鹽水，弗氏完全佐劑1∶1混合），分別于第1、3、5、7天腹腔注射給藥1次，用以增強致敏效果，第18天尾靜脈注射110%卵蛋白3 mL[10]。對照組按體重給予生理鹽水，每100 g體重給予0.5 mL生理鹽水，分別于第1、3、5、7天腹腔注射生理鹽水1次，第18天尾靜脈注射3 mL生理鹽水，乙醚吸入麻醉后斷頸處死。本研究通過佳木斯大學動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

雞卵蛋白和弗氏完全佐劑，美國Sigma-Aldrich公司；大鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SP、HK-1、NK1R），上海勁馬實驗設(shè)備有限公司；Total RNA提取試劑（TRIzol），美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR反應(yīng)體系，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；蘇木素，上海藍季科技發(fā)展有限公司；伊紅溶液，天津市光復(fù)精細化工研究所。

FA2104A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；EG1160智能包埋機，中國科學器材進口總公司；RM2235型切片機，德國Leica公司；TEC-2800-C攤片機，郝恩琳（常州）醫(yī)用儀器有限公司；TProfessional Thermocycler PCR儀，德國Biometra公司；LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀，美國Roche公司；CX23LEDRFS1C型生物顯微鏡，奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

各組肺部和胃腸組織固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進行常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 ELISA法

標準品按照ELISA試劑盒說明書配制，提取肺部和胃腸組織研磨后提取組織液，稀釋加樣后溫育加酶并顯色，并以空白孔為參照，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品物質(zhì)濃度。標準曲線方程為Y=-0.175 0+145.813 8X，R2=0.996 8。

1.3.3 qRT-PCR法

按照說明書提取肺部和胃腸組織總RNA，之后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再用熒光定量PCR儀進行PCR擴增，并采用2-△△CT法對HK-1的相對含量進行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR反應(yīng)的引物設(shè)計

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件和GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，各組間的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物建模觀察

對照組尾靜脈注射生理鹽水后無明顯變化。實驗組尾靜脈注射OVA溶液后，大鼠先是叫聲尖利，后出現(xiàn)躁動，呼吸急促，隨后抽搐，最后趴伏，約60 min內(nèi)死亡[11]。

2.2 組織學觀察

切片進行HE染色后，顯微鏡下觀察，各組織HE染色結(jié)果如圖1所示。

圖1 大鼠肺部和胃腸組織HE染色組織學觀察（×400）

實驗組大鼠可見喉頭、氣管黏膜水腫，黏膜下層可見嗜酸性粒細胞浸潤。肺泡壁間隔增寬，且部分肺泡壁破裂，間質(zhì)毛細血管內(nèi)淤積大量紅細胞，且有炎癥細胞滲出至肺泡腔內(nèi)。肺泡腔有少許均質(zhì)粉染的水腫液和纖維滲出。肺泡壁間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤（圖1A～圖1E）。胃腸壁淤血，胃腸黏膜間質(zhì)血管擴張充血且腺體細胞和血管周圍有大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。7 d冷凍組組織自溶嚴重，但亦可見炎性細胞浸潤。對照組除了可見不同程度組織自溶外，其余均正常（圖1F～圖1J）。這說明實驗組大鼠有明顯的過敏性病理組織學癥狀的表現(xiàn)，本實驗OVA致大鼠過敏性猝死模型建造成功。

2.3 ELISA結(jié)果

由表2可知，與對照組相比，各實驗組肺部和胃腸組織中HK-1蛋白相對表達量均增高，且0 h死亡組、24 h常溫組、48 h冷藏組表達量顯著升高（P＜0.05），但3個處理組間差異不顯著（P＞0.05）；7 d冷凍組表達量與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ELISA結(jié)果表明，長時間的冷凍后解凍和反復(fù)凍融導致的尸體腐敗和組織自溶可能對HK-1蛋白的檢測有一定的影響。

表2 大鼠肺部及胃腸組織HK-1的ELISA檢測結(jié)果（單位：pg/mL）

2.4 qRT-PCR結(jié)果

由表3可知，與對照組相比，7 d冷凍組的肺部和胃腸組織中HK-1 mRNA的相對表達量沒有顯著變化（P＞0.05）；0 h死亡組、24 h常溫組和48 h冷藏組肺部組織中HK-1 mRNA相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著保藏時間的延長而下降，各處理組間差異顯著（P＜0.05）；0 h死亡組、24 h常溫組和48 h冷藏組胃腸組織中HK-1 mRNA相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著保藏時間的延長而先上升后下降，各處理組間差異顯著（P＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果說明，長時間的冷凍后解凍和反復(fù)凍融導致的尸體腐敗和組織自溶對HK-1mRNA的檢測有一定的影響。

表3 大鼠肺部及胃腸組織HK-1 mRNA相對表達量水平

3 結(jié)論

通過對HK-1在大鼠過敏性猝死時肺部和胃腸組織中的實驗性研究，觀察其在不同時間和儲存條件下的表達和變化情況，從而判斷其在過敏性猝死中的法醫(yī)學診斷意義和價值。結(jié)果表明，過敏性猝死大鼠肺部和胃腸組織0 h死亡組、24 h常溫組、48 h冷藏組中HK-1蛋白和mRNA的表達水平均高于正常對照組，7 d冷凍組與對照組差別不明顯。說明過長時間冷凍及解凍尸體可降低HK-1的表達，可為過敏性猝死48 h內(nèi)的法醫(yī)學鑒定提供一定的參考價值，但缺乏一定的定量結(jié)果，故對長時間冷凍尸體的過敏性猝死的法醫(yī)學鑒定仍需進一步的研究和探索。