吳志宇，周革非，陳慧敏，湯 佳，謝章彰*，劉芳華*

1. 煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264003

2. 廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，華南土壤污染控制與修復國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650

3. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006

分子氫(H2)在水稻田土壤中扮演著重要角色.首先，H2作為一種理想的電子供體，能夠被產(chǎn)甲烷菌、固氮菌、異化鐵還原菌等微生物利用，并參與鐵/錳氧化物、CO2等物質(zhì)的還原過程[1-4]. 其次，稻田土壤重金屬含量是水稻種植中需嚴格控制的環(huán)境因素[5-6]，H2可以通過還原作用固定諸如鉛、鎘等重金屬，減輕土壤重金屬污染程度，如H2可以與硫酸鹽還原過程耦合，產(chǎn)生的硫離子可以與鉛、鎘等重金屬離子結合并沉降[7]. 此外，H2處理能夠加快水稻種子萌發(fā)、促進幼苗根系的生長，還可以降低水稻對重金屬的吸收量. 由于產(chǎn)氫微生物的產(chǎn)氫活動是稻田土壤中H2的主要來源[8]，因此，產(chǎn)氫微生物對稻田土壤微生物的代謝活動及水稻的生長起著重要作用.

在水稻田土壤中，氮源是一種重要的營養(yǎng)元素，影響作物的生長及水稻田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定. 氮源的輸入對水稻等作物的產(chǎn)量影響極大. 除人工施肥外，固氮微生物的固氮作用是水稻田中氮素的重要來源. 固氮微生物可以將N2在固氮酶作用下轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，并轉(zhuǎn)化為氨基酸等有機物供給生物體生長[9]. 常見的固氮微生物有固氮菌屬(Aztobacersp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[10-11]. 固氮反應同時也是放氫過程，但固氮菌的產(chǎn)氫能力有限，絕大部分固氮作用產(chǎn)生的H2會被固氮菌自身利用[12].

目前，針對水稻田土壤中單獨具有產(chǎn)氫能力和固氮能力微生物的研究較多，如王永忠等[13]發(fā)現(xiàn)從稻田淤泥中可以篩選得到高效產(chǎn)氫菌；金月波[14]發(fā)現(xiàn)，額外施加稻田來源的固氮菌能夠顯著提高水稻的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量. 然而，關于具有協(xié)同固氮產(chǎn)氫能力微生物的研究卻仍舊缺乏，針對此類微生物的挖掘和研究將有助于揭示稻田土壤中協(xié)同固氮-產(chǎn)氫微生物的生態(tài)作用，并為其實際應用提供理論基礎. 該研究從華南稻田土壤樣品中定向篩選具有協(xié)同固氮產(chǎn)氫能力的微生物，并對其固氮產(chǎn)氫特性進行研究，以期為研究稻田微生物協(xié)同固氮產(chǎn)氫過程提供新的微生物資源.

1 材料與方法

1.1 樣品獲取

采集華南稻田(113°52′51″E、23°03′43″N)土壤樣品：于2021年12月，用取樣器采集深度為0~40 cm的稻田土1.5 kg，用聚乙烯樣品袋盛放樣品，4 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2 產(chǎn)氫富集物培養(yǎng)

將50 g土壤樣品與500 mL去除氮源的MSG培養(yǎng)基[15](MSG-N?培養(yǎng)基)混合(去除蛋白胨、半胱氨酸和氯化銨)，用磁力攪拌器混勻，并通入高純氮氣(N2)除氧30 min. 用移液管將混合懸濁液分裝至120 mL的厭氧瓶中，每瓶50 mL，用膠塞封口，放置于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育5~7 d；之后每3 d轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接量為5%，培養(yǎng)基為無菌除氧的MSG培養(yǎng)基.

MSG-N?培養(yǎng)基成分：NaCl 5 g，K2HPO42.1 g，KH2PO40.54 g，微量元素溶液10 mL，葡萄糖10 g，蒸餾水1 L.

微量元素濃縮液成分：NaCl 6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，MgCl2·6H2O 2 g，F(xiàn)eCl2·4H2O 40 mg，ZnCl21 mg，MnCl2·4H2O 1 mg，CuCl2·2H2O 0.6 mg，AlCl31 mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1 mg，CoCl3·6H2O 4 mg，硼酸飽和溶液20 μL，濃鹽酸20 μL，生物素0.04 mg，葉酸0.04 mg，維生素B60.2 mg，核黃素0.1 mg，維生素B10.1 mg，煙酸0.1 mg，維生素B120.1 mg，對氨苯甲酸0.1 mg，泛酸0.1 mg，蒸餾水1 L.

1.3 產(chǎn)氫菌的分離和鑒定

將富集物逐級稀釋104~107倍，用Hungate滾管法分離單菌落[16]. 將滾管后冷卻的厭氧管放置于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)48 h. 在厭氧箱中挑取單菌落，接入200 μL無菌生理鹽水中，再轉(zhuǎn)接到含有20 mL滅菌除氧的MSG培養(yǎng)基的厭氧瓶中，37 ℃下培養(yǎng). 培養(yǎng)基產(chǎn)生明顯渾濁后，取100 μL菌液作為PCR模板，對其16S rRNA基因擴增，剩余菌液用于傳代和菌種保藏.

PCR擴增體系：2×Taq mix 12.5 μL，通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，菌液模板0.5 μL，ddH2O 10 μL，體系總體積25 μL. PCR程序：預熱95 ℃，5 min. 循環(huán)程序：裂解95 ℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；循環(huán)30次. 終延伸72 ℃，10 min. 4 ℃下保存. 將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并送樣于生物工程(上海)股份有限公司測序. 將測序結果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(Genebank登記號為ON259312.1)，并在該數(shù)據(jù)庫中進行在線Blast比對. 使用MEGA X繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 形態(tài)觀察

取2 mL菌液于離心管中，5 000 r/min下離心3 min，用無菌水重懸重復離心，加入2.5%戊二醛5 mL重懸浮，置于4 ℃下環(huán)境過夜，依次用30%、50%、70%、90%和100%濃度的乙醇脫水，將脫水后得到的菌體凍干后噴金鍍膜. 將制備好的樣品置于掃描電鏡(Phenom ProX)下進行微生物形態(tài)觀察[17].

1.5 代謝特征檢測

1.5.1生長檢測

將處于生長期的菌液接種到新鮮MSG培養(yǎng)基中，37 ℃下避光培養(yǎng)，每2 h取樣一次，用紫外分光光度計測量600 nm處的吸光度(記作OD600).

1.5.2底物消耗檢測

使用3,5-二硝基水楊酸法測定樣品中葡萄糖含量[18].

檢測液成分：3,5二硝基水楊酸6.3 g，NaOH 21 g，KNaC4H12O10·4H2O 182 g，苯酚5 g，NaSO35 g，蒸餾水1 L. 4 ℃下靜置7~10 d后使用.

將發(fā)酵液稀釋20倍與檢測液以體積比1∶3混合，100 ℃下水浴5 min. 檢測540 nm處的吸光度.

1.5.3有機酸產(chǎn)物檢測

取0.5 mL菌液，用去離子水稀釋2倍，3 000 r/min下離心3 min，取上清液，通過0.22 μm濾膜. 使用液相色譜(Agilent1260，安捷倫，德國)檢測培養(yǎng)基中有機酸產(chǎn)物(乙酸、乳酸、丁酸)的濃度變化.

液相色譜條件：C18柱(C18-WR 5 μm，島津，日本)，柱溫35 ℃，流動相為18 mmol/L磷酸二氫鉀，流速1.2 mL/min，紫外檢測器，波長為218 nm.

1.5.4產(chǎn)氫量檢測

用氣相色譜進樣針取頂空樣品200 μL，用氣相色譜(Agilent8860，安捷倫，德國)檢測氣體成分，根據(jù)標準曲線換算氣體分壓，用自由氣體方程〔見式(1)〕計算H2物質(zhì)的量.

式中：P為氣體分壓，取值為101 kPa；V為氣體體積，m3；n為氣體物質(zhì)的量，mol；R為普適氣體常數(shù)，取值為8.314 4 J/(mol·K)；T為氣體溫度，取值為198 K.

氣相色譜條件：TCD檢測器，檢測器溫度150 ℃，進樣口溫度80 ℃，柱溫箱80 ℃，N2作載氣，流速10 mL/min.

1.5.5固氮能力檢測

生物量檢測：配制MSG-N?培養(yǎng)基，分別用高純N2和高純氬氣(Ar)除氧并滅菌. 接種BZ-1種子液，接種量為5%. 分別檢測N2試驗組和Ar試驗組發(fā)酵液600 nm處的吸光度以及培養(yǎng)體系中NH4+濃度.

NH4+濃度檢測：采用靛酚藍-分光光度法[19]. 反應體系和條件：①檢測液A，苯酚10 g，1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液4 mL，蒸餾水1 L；②檢測液B，NaOH 5 g，C6H5Na3O74 g，NaClO溶液7 mL，蒸餾水1 L；③將檢測液A、B各5 mL混合后，加入發(fā)酵液200 μL，37 ℃下孵育15 min，測定637 nm處的吸光度.

固氮酶活性檢測：使用乙炔還原法檢測固氮活性. 取25 mL容積血清瓶，密封后，將氣體置換為Ar，加入1%體積的乙炔氣體，備用. 檢測固氮酶活性時取1.5 mL菌液加入備用的血清瓶中，37 ℃下孵育1.5 h，用氣相色譜檢測乙烯產(chǎn)生量.

1.6 統(tǒng)計學分析

所有試驗均設置3個平行，使用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析.

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)氫菌株的分離與鑒定

富集培養(yǎng)液經(jīng)過多次傳代后，用Hungate滾管法分離并純化得到一株產(chǎn)氫菌，命名為菌株BZ-1. 菌株BZ-1菌落呈淡黃色，形狀為光滑圓形. 如圖1(掃描電鏡檢測結果)所示，在放大倍數(shù)為1.95萬倍的視野下，菌株BZ-1呈棒狀，長3~4 μm，寬0.3~0.5 μm，表面相對光滑.

圖 1 菌株BZ-1掃描電鏡圖像Fig.1 Electron microscope image of strain BZ-1

通過16S rRNA基因序列的測序和比對確定所分離菌株BZ-1的系統(tǒng)發(fā)育地位. 經(jīng)Blast比對，該菌株與Clostridium pasteurianumDSM525的序列相似性最高，為98.43%. 將BZ-1菌株與另外幾株產(chǎn)氫梭狀芽孢桿菌和其他典型的產(chǎn)氫、固氮菌株的16S rRNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)，發(fā)現(xiàn)菌株BZ-1與Clostridium pasteurianumDSM525處于同一分枝.綜上，菌株BZ-1鑒定為梭狀芽孢桿菌屬.

圖 2 基于16S rRNA基因序列構建的菌株BZ-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BZ-1 based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株BZ-1產(chǎn)氫特性

避光條件下，在37 ℃的MSG培養(yǎng)基中，5%接種量的菌株BZ-1在60 h內(nèi)的產(chǎn)氫總量為42.19 mmol/L〔見圖3(a)〕. 菌株BZ-1的生長遲滯期小于5 h，對數(shù)期為5~10 h，在17 h左右生物量達到最大，OD600值為1.45，隨后生物量緩慢下降〔見圖3(b)〕. 前27 h葡萄糖消耗較快〔見圖3(d)〕，平均速率為1.30 mmol/(L·h).隨著菌株BZ-1利用葡萄糖產(chǎn)生的有機酸不斷累積，培養(yǎng)基pH不斷下降，當pH<4.3后，菌株BZ-1代謝葡萄糖速率大幅下降，在該體系中，葡萄糖總消耗量為34.55 mmol/L.

通過氣相色譜和液相色譜檢測菌株BZ-1的代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵葡萄糖主要產(chǎn)物為H2、CO2和有機酸.菌株BZ-1發(fā)酵產(chǎn)氫的底物轉(zhuǎn)化率為1.22 mol/mol(以每mol葡萄糖產(chǎn)生多少mol H2計)，有機酸產(chǎn)物主要為丁酸(15.96 mmol/L)，其次為乙酸(7.14 mmol/L)和乳酸(5.09 mmol/L)〔見圖3(c)〕.

2.3 菌株BZ-1固氮能力

菌株固氮生長能力檢測結果如表1所示，菌株BZ-1在MSG-N?培養(yǎng)基中于頂空Ar環(huán)境下培養(yǎng)36 h后，菌株BZ-1的OD600值僅達到0.36，而在N2環(huán)境中，36 h時菌株BZ-1的OD600值為1.47，顯著高于Ar試驗組，說明菌株BZ-1可以通過固氮作用利用N2進行生長.

2.4 菌株BZ-1協(xié)同固氮產(chǎn)氫特性

菌株BZ-1在有/無氯化銨的MSG-N?培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的產(chǎn)氫量檢測結果如圖4(a)所示，發(fā)現(xiàn)在以20 mmol/L葡萄糖為底物的發(fā)酵產(chǎn)氫試驗中，無氯化銨試驗組前期產(chǎn)氫速率較慢，但最終產(chǎn)氫量較高，其最高產(chǎn)氫量為30.85 mmol/L，相比于3 mmol/L和7 mmol/L氯化銨氮源試驗組的26.25 mmol/L和26.89 mmol/L分別提高了17.49%和14.71%.

不同氮源含量的MSG培養(yǎng)基中，菌株BZ-1的生物量、底物濃度和pH隨時間的變化以及有機酸產(chǎn)物的最終濃度結果表明，在以N2為唯一氮源的培養(yǎng)體系中，其生物量增長較慢，到達平臺期的時間晚于以氯化銨為氮源的兩個試驗組；菌株BZ-1的最大生物量也更低，相比于添加7 mmol/L氯化銨的試驗組，最大生物量降低了33.33%〔見圖4(b)〕. 在前24 h，相較于未添加氯化銨的試驗組，以氯化銨為氮源的試驗組生物量增長較快，葡萄糖底物消耗較快〔見圖4(c)〕，葡萄糖的快速消耗導致體系內(nèi)有機酸發(fā)酵產(chǎn)物累積速度加快，使體系pH下降也較快〔見圖4(d)〕. 由于氯化銨的消耗會降低體系pH，所以添加氯化銨作為氮源的試驗組的最終pH也略低于未添加氯化銨的試驗組. 值得注意的是，不同試驗組中的乙酸產(chǎn)量存在明顯差異〔見圖4(e)〕，未添加氯化銨試驗組的乙酸產(chǎn)量為8.79 mmol/L，相比于添加3和7 mmol/L氯化銨的試驗組產(chǎn)乙酸濃度分別提升了63.22%和61.49%.

圖 3 在MSG培養(yǎng)基中菌株BZ-1的代謝情況Fig.3 Metabolism of strain BZ-1 in MSG medium

表 1 菌株BZ-1在N2和Ar環(huán)境的無氮源培養(yǎng)體系中36 h內(nèi)生物量和NH4+濃度Table 1 The accumulation of biomass and ammonium ions of strain BZ-1 in N2 and Ar environment without nitrogen source

該研究進一步測定了菌株BZ-1在不同培養(yǎng)體系中的固氮能力，發(fā)現(xiàn)在未添加氯化銨的試驗組中，雖然生物量較低〔見圖4(b)〕，但乙炔還原量顯著高于添加7 mmol/L氯化銨的試驗組〔見圖4(f)〕. 這說明在無氯化銨的培養(yǎng)體系中，菌株BZ-1具有較高的固氮酶活性. 同時發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氫停滯后(48 h)BZ-1的固氮能力也大幅下降，表明BZ-1的固氮過程和產(chǎn)氫過程在時間上具有一定的同步性.

圖 4 不同氮源濃度對菌株BZ-1產(chǎn)氫代謝的影響Fig.4 Effects of different nitrogen contents on hydrogen production and metabolism of strain BZ-1

2.5 討論

利用厭氧培養(yǎng)聯(lián)合亨蓋特滾管技術，從華南稻田土壤樣品中篩選得到了一株具有協(xié)同固氮產(chǎn)氫能力的梭菌BZ-1.

在菌株BZ-1的固氮能力檢測中發(fā)現(xiàn)，菌株BZ-1可以利用N2作為氮源產(chǎn)生生物量，說明該菌株具有固氮生長能力. 兩個試驗組中均未檢測到胞外NH4+，說明菌株BZ-1固定N2產(chǎn)生的NH4+未釋放到胞外，推測BZ-1固氮作用產(chǎn)生的NH4+全部在胞內(nèi)被用于細胞生長和代謝.

在菌株BZ-1協(xié)同固氮產(chǎn)氫的試驗中發(fā)現(xiàn)，協(xié)同固氮產(chǎn)氫試驗組的產(chǎn)氫量相較于添加3 mmol/L氯化銨的試驗組增加了14.72%. 可以看出，當固氮作用和產(chǎn)氫作用同時進行時，菌株BZ-1的產(chǎn)氫能力得到了增強. 發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基中氮源含量充足時，高濃度氮源會抑制固氮酶的活性[20]，因而當培養(yǎng)體系中存在一定濃度的氯化銨時，菌株BZ-1的固氮酶活性較低.H2是微生物固氮作用的副產(chǎn)物[21-22]，菌株BZ-1固氮活性的提高可能有利于其產(chǎn)氫量的提升.

另外，菌株BZ-1協(xié)同固氮產(chǎn)氫時的最終生物量低于以氯化銨為氮源生長時的生物量. 由于微生物生物量的增加需要合成各類多糖、蛋白和其他物質(zhì)，會消耗大量的底物以產(chǎn)生足夠的能量與還原力[23]，因而生物量的下降有利于降低底物的消耗. 在菌株BZ-1協(xié)同固氮產(chǎn)氫時，其較低的生物量可能會使更多的底物和還原力流向產(chǎn)氫途徑，最終提升菌株BZ-1的產(chǎn)氫量.

此外，試驗中還觀察到，協(xié)同固氮產(chǎn)氫試驗組的乙酸產(chǎn)量顯著增加. 由于[Mo-Fe]固氮酶催化的固氮反應需要消耗大量的ATP與NADH[24]，而相比于產(chǎn)乳酸與產(chǎn)丁酸代謝途徑，產(chǎn)乙酸代謝途徑能夠產(chǎn)生更多的ATP與NADH，所以菌株BZ-1固氮生長時，產(chǎn)乙酸代謝途徑會被上調(diào)，并依此提高乙酸產(chǎn)量. 此外，相比于產(chǎn)乳酸和產(chǎn)丁酸途徑，產(chǎn)乙酸途徑的單位底物產(chǎn)氫量更高[25-26]，菌株BZ-1產(chǎn)乙酸代謝途徑的上調(diào)將有利于其產(chǎn)氫.

在菌株BZ-1的固氮能力檢測試驗中發(fā)現(xiàn)，菌株BZ-1可以利用N2作為唯一氮源進行生長，但未在培養(yǎng)基溶液中檢測到NH4+，說明在實驗室培養(yǎng)條件下菌株BZ-1不會主動向胞外輸送氮源. 然而在實際稻田土壤的復雜條件下，菌株BZ-1固定的氮源可能會隨著細胞的死亡而釋放到環(huán)境中，并被其他生物所利用[27]. 即菌株BZ-1可能同時具備向稻田土壤中輸入有機氮和H2的能力. 土壤微生物固氮及產(chǎn)氫活性的增強有利于改善土壤肥力、提高農(nóng)作物產(chǎn)量[28-30]. 例如：柯玉詩等[31]用耐氨固氮菌處理稻田土壤，發(fā)現(xiàn)在低氮條件下早稻和晚稻產(chǎn)量分別提高了8.41%和7.21%；Cheng等[32]發(fā)現(xiàn)，H2處理降低了谷物中的鎘積累量，同時提高了谷物中支鏈淀粉的含量；Zeng等[33]發(fā)現(xiàn)，H2通過調(diào)節(jié)激素信號通路，從而影響水稻的抗逆性. 我國是水稻種植大國[34]，菌株BZ-1的協(xié)同固氮產(chǎn)氫能力使其可以在提高稻田土壤肥力的同時，提高稻田土壤微生物代謝活性并緩解鉛、鎘等重金屬對水稻的脅迫作用，有利于提高糧食產(chǎn)量、保障糧食安全. 此外，在“雙碳”背景下，梭菌還是一類理想的產(chǎn)氫微生物[21,35]，研究協(xié)同固氮產(chǎn)氫作用對提高梭菌產(chǎn)氫效率也有重要意義.

3 結論

a) 該研究從稻田土壤樣品中分離得到一株具有協(xié)同固氮產(chǎn)氫能力的梭菌?Clostridium sp. BZ-1.

b) 在有機氮源充足條件下菌株BZ-1發(fā)酵20 mmol/L葡萄糖可以產(chǎn)生26.89 mmol/L的氫氣，當以N2為唯一氮源時，菌株BZ-1產(chǎn)氫量可以提升至30.85 mmol/L.

c) 菌株BZ-1固氮酶活的提升、生物量的降低以及代謝途徑的改變可能是其在固氮產(chǎn)氫條件下產(chǎn)氫量提升的原因.