馮 健

胰腺炎（pancreatitis）是常見的腹部外科疾病之一，由多種原因引起，包括膽石癥、酒精中毒或高脂血癥等，在我國最常見的病因為膽石癥。胰腺炎可分為急性胰腺炎（acute pancreatitis AP）和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis CP)，AP特征為胰腺的急性炎癥反應，嚴重程度不一，80%屬于輕癥急性胰腺炎；CP的特征是有顯著的基質(zhì)形成，伴有大量浸潤性粒細胞（例如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞）、單核細胞、巨噬細胞和胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells, PSCs）。二者并非完全獨立疾病、研究發(fā)現(xiàn)，20%的AP會表現(xiàn)為胰腺炎內(nèi)、外分泌功能不全，10%的初次發(fā)病AP和20%反復發(fā)作AP，最終發(fā)展為CP[1]。在胰腺損傷過程中，可激活炎癥細胞如巨噬細胞和粒細胞，釋放多種炎性因子，白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。這些炎性因子進一步激活PSCs發(fā)展為CP。胰腺炎發(fā)病機制復雜，有多條自分泌和旁分泌信號通路參與，彼此相互作用構(gòu)成一個錯綜復雜的網(wǎng)絡。為了解胰腺炎的發(fā)病機制和病理變化，構(gòu)建胰腺炎動物模型至關(guān)重要，其可模擬人類胰腺炎的病變過程，滿足不同的研究需要。現(xiàn)將近年來胰腺炎動物模型及相關(guān)信號通路的研究進展作如下綜述。

1 胰腺炎模型

胰腺的解剖位置特殊，且在胰腺炎發(fā)病的不同階段獲得人體組織非常困難。通過構(gòu)建胰腺炎動物模型可以模擬胰腺炎的發(fā)病過程，研究胰腺炎的發(fā)病機制，制定更有效的治療方法。

1.1 雨蛙肽誘導的胰腺炎模型 雨蛙素由澳洲蛙的皮膚中分離，結(jié)構(gòu)與膽囊收縮素（CCK）相似，具有促進蛋白水解酶分泌的功能，導致胰腺腺泡內(nèi)酶原過早激活釋放，損傷胰腺組織。Lampel等[2]于1997年最先給大鼠持續(xù)滴注超大劑量的雨蛙素，在1 h內(nèi)誘導出急性水腫性胰腺炎，之后胰腺損傷逐漸加重，并于12 h達到高峰。雨蛙素誘導的胰腺炎模型操作簡單、穩(wěn)定性強，是目前應用最廣泛的AP模型。

1.2 膽胰管注射模型 Schmidt等[3]于1992年采用逆行胰膽管內(nèi)注射甘氨脫氧膽酸 (glycodeoxycholic acid，GDOC)的方法，導致大鼠胰腺組織出現(xiàn)急性出血壞死。此方法被大家普遍接受，目前為比較規(guī)范的AP造模方法。該模型在病因病機及病理等方面與臨床上的急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）相似。膽汁反流致胰腺炎是由膽囊結(jié)石或膽汁反流阻塞進入胰管，導致胰腺水腫，炎性細胞浸潤，淀粉酶產(chǎn)生增加，誘發(fā)急性胰腺炎，故可以模仿膽源性胰腺炎，該方法優(yōu)點是可重復、可對比，模型選擇性強，缺點是操作費時，注藥速度不易控制，只能借助微量泵才能維持理想的注藥速度。

1.3 L-精氨酸誘導的胰腺炎模型 L-精氨酸（L-Arg）誘導的模型可產(chǎn)生腺泡細胞壞死，廣泛用于研究急性壞死性胰腺炎的病理生理學改變。最初，Mizunuma等[4]和Tani等[5]證實了在大鼠靜脈注射過量的L-精氨酸（500 mg/100 g體重）可誘導胰腺腺泡細胞的損傷。在72 h內(nèi)觀察到約75%的腺泡細胞出現(xiàn)壞死，電鏡下可見明顯的酶原脫顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。其機制可能是注射過量的L-Arg后，胰腺腺泡細胞的氨基酸代謝失衡，蛋白酶合成減少，通過負反饋調(diào)節(jié)導致酶原被過度激活。其缺點是模型成活率低，胰腺損傷程度不易控制。尚宏清等[6]采用將大劑量L-Arg分次注射的方法，在一定程度上雖降低了模型動物的死亡率，但仍然無法控制胰腺病理改變，故該方法還有待進一步完善。

1.4 膽鹽誘發(fā)的胰腺炎模型 第一個實驗性膽道急性胰腺炎模型由Bernard[7]于1856年通過將膽汁和橄欖油逆行注射到犬的胰腺中而建立，被廣泛使用和最佳表征的化學物質(zhì)，并且用于誘導AP。此外膽堿缺乏，補充乙硫氨酸飲食模型是另一個研究AP和CP發(fā)病機制的模型。

1.5 結(jié)扎模型 結(jié)扎法是一種制作AP動物模型比較簡單常見的方法，可模仿膽源性胰腺炎。Pfeffer等[8]于1957年首先提出十二指腸閉襻結(jié)扎法。該模型設計原理是模仿人膽管結(jié)石致膽道梗阻時，十二指腸腔內(nèi)壓力升高，使膽汁返流進入胰管，膽汁內(nèi)的膽汁卵磷脂被胰液內(nèi)的磷脂酶A2分解成溶血卵磷脂；后者可導致胰內(nèi)蛋白酶在胰腺內(nèi)被過早激活，破壞細胞膜和導管，導致胰腺組織自身消化。CP小鼠模型中可觀察到胰腺萎縮、腺泡細胞損失和纖維化[9]。結(jié)扎法更符合動物倫理，損傷輕微，模型同樣穩(wěn)定，但對實驗人員的要求也更高。

1.6 酒精性胰腺炎模型 酒精是引起胰腺炎發(fā)病的另一個重要因素，在動物模型中它被用來引發(fā)CP[10]。Lieber等[11]通過反復給大鼠和狒狒喂食乙醇作為飲食的一部分來研究乙醇對幾個器官的影響，這些動物出現(xiàn)了脂肪性肝病、酒精性肝炎以及后來的肝硬化。令人遺憾的是，盡管實驗持續(xù)時間較長，但僅攝入酒精并不能誘發(fā)CP。然而，酒精與各種藥物（如谷胱甘肽或溶血磷脂）的結(jié)合會加重胰腺炎并導致纖維化。在大鼠觀察中，給予等熱量利伯-德卡利液體飼料和酒精長達10周，并給予1或3次重復劑量的脂多糖，致使大鼠胰腺星狀細胞活化和纖維化。酒精引起的胰腺損傷被認為是由其代謝產(chǎn)物介導的，這種代謝產(chǎn)物激活活性氧，導致腺泡細胞損傷，激活胰腺星狀細胞，導致纖維化[12]。

2 分子信號通路

2.1 核因子(NF)-κB NF-κB是一種廣泛存在于人體組織細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，可參與調(diào)節(jié)機體炎癥反應、胚胎發(fā)育、組織損傷和器官修復等生理反應。在外界刺激因子作用下，NF-κB可被激活，調(diào)控炎性因子、生長因子、化學趨化因子、巨噬細胞趨化肽、細胞黏附因子、C反應蛋白(CRP)等相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄[13]。目前學者普遍認為NF-κB的活化參與了AP的發(fā)病發(fā)展過程，NF-κB活化引起炎癥因子的級聯(lián)瀑布式反應，進而導致局部或全身的炎癥反應綜合征和多器官功能衰竭，可以說NF-κB的活化是AP重要的起始因素之一。目前認為，NF-κB在許多疾病中過度表達，如潰瘍性結(jié)腸炎、艾滋病(AIDS)、支氣管哮喘、感染性休克等，尤其是在SAP中的作用是研究的熱點領(lǐng)域，同時也存在爭論。Samuel等[14]通過結(jié)扎法建立AP模型，在胰腺組織中可以檢測到NF-κB活性顯著增高，并引起下游TNF-α的水平相應增加。在胰外器官實驗中也發(fā)現(xiàn)NF-κB高表達，活化的NF-κB可與炎性因子相關(guān)的表達基因位點相結(jié)合，調(diào)控炎性細胞因子的分泌，加重肝細胞損傷。但也有少數(shù)學者表示出不同的觀點，Steinle等[15]研究表明，在AP發(fā)病過程中，NF-κB的活化早于胰腺損傷，可誘導參與自身防御的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，防止胰腺腺泡細胞損傷，應用NF-κB抑制劑后反而會加重胰腺損傷；故認為NF-κB的激活可以防御應激反應，保護細胞免受損害。該實驗結(jié)果的差異可能與胰腺炎動物模型的炎癥程度和取材時間點有關(guān)。

2.2 TGF-β/ SMAD TGF-β是一種多能細胞因子，在哺乳動物中以三種同種型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）存在，在調(diào)節(jié)免疫應答、細胞生長、細胞分化和凋亡中發(fā)揮著不可或缺的作用[16]。TGF-β通過與其特異性受體結(jié)合而介導其下游信號傳導，并觸發(fā)幾種SMAD蛋白的激活，這些SMAD蛋白充當從受體到細胞核的信號的主要轉(zhuǎn)導物。受體調(diào)節(jié)的SMAD（R-SMADs）、SMAD-2和SMAD-3被TGF-β1受體直接磷酸化，并與易位的常見介體SMAD（即co-SMAD、SMAD-4）形成復合物進入細胞核并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。早期研究已證實TGF-β參與了AP、CP和纖維化的發(fā)病機制。PSC在誘發(fā)胰腺纖維化，通過參與SMAD-2、SMAD-3和ERK途徑以自分泌方式調(diào)節(jié)激活和增殖TGF-β中起著關(guān)鍵作用。通過過度表達TGF-β2型受體(pS2-dnR II)的顯性負突變形式，僅在ps2/tff1啟動子的控制下，觀察了用有缺陷的TGF-β信號轉(zhuǎn)導改善雨蛙肽治療小鼠胰腺纖維化的效果。隨后的研究顯示，TGF-β信號傳導的抑制可以阻止雨蛙肽誘導的胰腺炎[18]。這些研究表明，神經(jīng)毒素可能需要一個功能性TGF-β信號通路來誘導這些小鼠的急性胰腺炎。相反，TGF-β信號的失活誘導小鼠自身免疫性胰腺炎，表明TGF-β在維持體內(nèi)免疫平衡和抑制自身免疫方面的重要作用，可以保持胰腺腺泡細胞的完整性。大量證據(jù)表明，TGF-β參與了胰腺纖維化，但也發(fā)現(xiàn)TGF-α通過上調(diào)MMP-1增加了PSC的增殖和遷移，這可能有助于了解CP的發(fā)病機制。最近的一份報告顯示，在促進胰腺化生、胰島發(fā)育和纖維化方面，Smad-4與TGF-α的過度表達失去協(xié)同作用。此外，在胰腺炎癥過程中，較高水平的TGF-β1會引起微RNA-217-SIRT1通路的放松調(diào)節(jié)，進而促進胰腺的纖維化。而且，TGF-β也激活了包括MAPK通路和磷酸肌醇（PI）3激酶在內(nèi)的SMAD獨立信號通路，但具體的機制還不太清楚。

2.3 MAPK 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）有三種類型，即ERK、JNK和P-38，在包括細胞增殖、細胞存活、凋亡和細胞因子產(chǎn)生在內(nèi)的多種細胞過程中起著重要作用[20]。在酒精性胰腺損傷中，乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛在PSC中誘導激活蛋白-1（AP-1）和MAPK信號[19]。此外，CX3CL1[20]是一種作為黏附分子和遷移因子的趨化因子，在酒精性CP患者中升高。最近的一項研究表明，乙醇通過ERK激活誘導PSCs中的CX3CL1釋放。然而，H2O2在PSC中誘導氧化應激、AP-1、MAP激酶途徑和α（I）前膠原的表達。除此之外，PDGF還誘導了Raf-1、ERK 1/2和AP-1蛋白的快速激活，進一步表明ERK活性和PSC激活之間存在相關(guān)性。此外，蛋白酶激活受體-2（PAR-2）參與了胰腺炎的發(fā)病機制，PAR-2激動劑通過激活PSCs中的JNK和P-38 MAP激酶途徑增加了膠原合成，提示PAR-2在誘導胰腺纖維化中的作用。PD98059是一種MAP/ERK激酶-1（MEK-1）途徑的抑制劑，能夠保護小鼠免受雨蛙肽誘導的急性胰腺炎的影響。除此之外，血管緊張素II治療的PSCs通過表皮生長因子受體激活ERK激活途徑開始增殖并增加DNA合成，這表明血管緊張素II可能在胰腺纖維化的發(fā)生中發(fā)揮作用?？傊?，這些研究拓寬了我們的知識，以了解MAPK信號通路在胰腺炎相關(guān)纖維化發(fā)展中的作用，但仍然存在幾種可能相互交叉的分子信號通路在其中起重要作用,對胰腺纖維化的具體機制仍需要進一步探索。

2.4 Rho激酶 在CP中，PSC的激活和誘導的應激纖維形成表明細胞骨架蛋白的重組參與了這種疾病的進程。RHO家族蛋白質(zhì)RhoA、Rac和Cdc42被認為是通過響應外部信號重塑細胞骨架來誘導應激纖維形成和調(diào)節(jié)細胞黏附的核心分子。此外，RhoA信號抑制劑通過抑制F-肌動蛋白聚集物降低了重癥急性胰腺炎患者肺損傷時內(nèi)皮細胞的高滲性。cyl Rho激酶抑制劑，如Y-27632和HA-1077（Fasudil），通過降低α-SMA、增殖、趨化性和培養(yǎng)激活的PSC中I型膠原的產(chǎn)生來阻斷PSC的活性[21]。在神經(jīng)毒素誘導的小鼠胰腺炎中，Y-27632在第一次注射雨蛙肽后12～18 h誘導血清淀粉酶水平升高、間質(zhì)水腫和空泡形成。Y-27632反過來抑制了第一次注射雨蛙肽18 h后Rock-II蛋白表達的恢復。這些結(jié)果表明，RhoA和Rock-II在正常CCK刺激的胰腺酶分泌中積累，并預防了雨蛙肽誘導的急性胰腺炎。在急性胰腺炎和隨后的CXC趨化因子形成、中性粒細胞浸潤和組織損傷過程中，發(fā)現(xiàn)Rho激酶信號調(diào)節(jié)胰蛋白酶原激活及其從胰腺腺泡細胞的釋放。

因此，這些結(jié)果表明，Rho激酶可能作為今后治療胰腺炎一個新的分子靶點，但尚需進一步了解Rho激酶信號在胰腺炎中的作用。這一領(lǐng)域為未來的研究開辟了一條新的道路。

2.5 JAK/STAT JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)多種細胞功能，如細胞增殖、分化和炎癥反應。IL-6是一種眾所周知的促炎細胞因子，通過JAK/STAT信號通路介導其作用，在胰腺炎的進展中起著關(guān)鍵作用[22]。各種報告表明，與健康人相比，胰腺炎患者的血清IL-6水平更高。此外，體外研究還表明，在多種炎癥介質(zhì)的影響下，如TNF-α、IL-17、IL-1β和FGF-2，誘導人胰腺腺泡周圍肌成纖維細胞分泌IL-6；這些數(shù)據(jù)進一步表明了IL-6在急性胰腺炎發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。研究證明，使用抗IL-6抗體阻斷IL-6可抑制胰腺腺泡細胞中的STAT-3激活，從而通過誘導胰腺腺泡細胞凋亡，降低急性胰腺炎的嚴重程度[23]。除此之外，另一項研究表明[24]，PDGF通過激活JAK-2/STAT-3通路誘導PSCs的增殖。JAK-1/STAT-1抑制劑通過抑制NF-κB的激活來減輕胰腺損傷的嚴重程度，這表明JAK-1/STAT-1的激活參與了胰腺損傷的早期事件。目前仍需更好地了解JAK / STAT信號通路，以了解其在PSCs增殖和CP纖維化進展中的作用。

2.6 PI3K-AKT PI3K-AKT是一個重要的細胞內(nèi)信號通路，屬于脂蛋白激酶家族[24]。當生長因子與膜結(jié)合受體酪氨酸激酶結(jié)合時，它激活PI3K及其下游調(diào)節(jié)因子Akt和mTOR，并調(diào)節(jié)細胞生長、存活、凋亡和炎癥等幾個方面。PI3K抑制劑可降低腺泡細胞中胰蛋白酶原的胰腺內(nèi)激活，并降低嚴重急性胰腺炎大鼠的炎性細胞因子，提示PI3K通路參與了急性胰腺炎的發(fā)病機制。PI3Kγ是PI3K的一種亞型，已知在胰腺炎期間調(diào)節(jié)胰腺腺泡細胞的病理反應。在兩種不同的急性胰腺炎模型中研究了PI3Kγ的作用：雨蛙肽和膽堿缺乏/蛋氨酸補充飲食，結(jié)果顯于缺乏PI3Kγ基因的小鼠受到腺泡細胞損傷/壞死的保護，急性胰腺炎的嚴重程度降低，表明PI3K抑制劑可能為急性胰腺炎提供一種可能的治療方法[24]。

本綜述介紹了雨蛙肽注射法、L-精氨注射法、胰管結(jié)扎法和酒精法制作動物AP模型，各法誘導胰腺炎模型機理不盡相同，大多具有重復性好、模型穩(wěn)定的優(yōu)點，但病理改變具有劑量和時間依賴性，研究人員需要根據(jù)具體要求選擇一種或兩種造模方法，更加符合臨床胰腺炎的發(fā)病過程和病理變化。采用幾種損傷因素協(xié)同作用制作CP動物模型，接近人類慢性胰腺炎發(fā)病過程，但損傷機制與人類慢性胰腺炎并不相關(guān)，不能完全反映人類CP的病理特征，導致實驗研究有一定局限性，目前多用于實驗研究藥物的治療效果。所以，目前的胰腺炎動物模型尚無一種能完全模擬胰腺炎臨床實際情況，將來應為胰腺炎的實驗研究設計更理想的動物模型。

胰腺炎發(fā)病機制復雜，臨床上多認為是胰酶異常激活引起胰腺的自身消化，導致大量炎性因子被釋放入血，造成胰腺實質(zhì)損傷；腸道屏障被破壞，菌群異位種植，內(nèi)毒素及細菌被吸收進入血液系統(tǒng)，觸發(fā)炎癥介質(zhì)的“瀑布樣級聯(lián)反應”,造成胰腺二次損傷，使得AP從局部病變迅速發(fā)展成為SIRS，進而導致MODS。

AP的“白細胞過度激活學說”認為外界各種損傷因素可以激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，釋放多種炎性因子，進而觸發(fā)炎癥介質(zhì)被大量釋放，導致全身炎癥反應和多臟器功能障礙，病情最終發(fā)展成為SAP。胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展及演變涉及多條信號通路協(xié)同作用，共同調(diào)控胰腺炎的病情變化。NF-κB是炎癥反應的中心信號通路，JAK/STAT、PI3K-AKT等多條信號通路都可通過其發(fā)揮生物效應。檢測MAPK可能對胰腺炎的早期診斷提供幫助。PI3K-AKT、MAPK在胰腺炎癥級聯(lián)反應放大中需要通過NF-κB作為下游信號分子介導，調(diào)控胰腺炎癥反應。實驗表明TGF-β、RHO激酶、JAK / STAT參與了胰腺纖維化過程。可見細胞內(nèi)多條信號通路共同參與介導胰腺炎癥反應，目前很多學者都在致力于揭示炎癥途徑中細胞內(nèi)信號級聯(lián)的相互作用，但由于人體內(nèi)信號通路彼此關(guān)聯(lián)復雜，仍有許多難點亟需攻克，比如信號通路相互作用的關(guān)鍵靶點、具體上下游信號如何相互影響、干擾或阻斷相關(guān)信號通路磷酸化及調(diào)控基因表達，從而抑制炎癥反應的關(guān)鍵節(jié)點。

3 展望

目前對于胰腺炎相關(guān)信號通路的研究取得一定進展，但其內(nèi)復雜網(wǎng)絡系統(tǒng)尚需深入探討。通過動物模型探討胰腺炎癥反應機制及相關(guān)信號通路的調(diào)控方法，深入了解胰腺炎的發(fā)病機制，為將來臨床上精準治療胰腺炎提供指導。