張小燕，王若楠，孫嘉星，豐星星，梁 亮，韓 驊，劉曉渭，晏賢春

(空軍軍醫(yī)大學(xué)： 1西京醫(yī)院腎臟內(nèi)科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 3腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室， 4西京醫(yī)院眼科，陜西 西安 710032)

近年來，隨著糖尿病、高血壓、肥胖等疾病的發(fā)病率日益增加，慢性腎臟病(chronic kidney diseases，CKD)的發(fā)病率也隨之逐年上升，已成為威脅公共健康的全球性疾病之一，患病率可達13.4%[1]。CKD是多種腎臟疾病的臨床統(tǒng)稱，疾病后期可演變?yōu)榻K末期腎衰竭和尿毒癥，甚至導(dǎo)致患者死亡。在此過程中，肌成纖維細胞在促纖維化因子的作用下顯著活化并產(chǎn)生大量病理性細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。ECM異常沉積可破壞腎組織正常結(jié)構(gòu)，促進纖維瘢痕形成，進而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不可逆性損傷。研究顯示，腎組織中肌成纖維細胞的來源主要有組織定居的成纖維細胞、骨髓來源的纖維細胞和單核-巨噬細胞、腎小管上皮細胞、內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)以及周細胞等[2-4]，其中ECs在多種外界因子及信號通路的作用下發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)，是肌成纖維細胞的重要來源。此外，EndMT可引起血管結(jié)構(gòu)功能異常，加重組織內(nèi)缺氧，可進一步導(dǎo)致腎組織其他類型細胞結(jié)構(gòu)功能異常，是加重腎纖維化進展的重要因素。研究表明，靶向阻斷EndMT過程可顯著延緩腎纖維化進程，而深入了解EndMT的調(diào)控機制是治療相關(guān)疾病的前提。因此，本文將對EndMT在腎纖維化中的作用及其調(diào)控機制的研究進展進行闡述。

1 EndMT是腎纖維化進展的重要因素

1.1 EndMT的基本概念

ECs的命運和功能具有高度可塑性，其在多種外界因素作用下可發(fā)生類似上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)樣的轉(zhuǎn)變，即EndMT。在該過程中，ECs間連接減弱，細胞極性丟失，細胞形態(tài)由鵝卵石樣轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N樣，其遷移、侵襲以及分泌能力增強。此外，ECs特征性基因如VE-cadherin、CD31、Tie1、Tie2和vonWillebrand因子等表達水平顯著降低，而間質(zhì)細胞特征性基因如α-SMA、Fsp-1、N-cadherin、SM22α、fibronectin、vimentin、Pdgfrβ和CD73等表達水平顯著上升[5-8]。研究表明，EndMT在多種組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，如在胚胎時期參與心臟瓣膜和隔膜形成，阻斷該過程可導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。在成年個體中，EndMT被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控腫瘤、動脈粥樣硬化以及肺動脈高壓等多種疾病進展，如在腫瘤中，ECs可通過EndMT轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細胞，發(fā)揮促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的作用。

1.2 EndMT參與調(diào)控腎纖維化進展

前期研究表明，ECs可通過EndMT直接轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，進而分泌大量ECM加速腎纖維化進程。ZEISBERG等[5]利用三種不同的腎纖維化模型結(jié)合ECs特異性遺傳示蹤小鼠(Tie2-Cre; R26R-stop-EYFP)首次發(fā)現(xiàn)纖維化的腎組織中有40%～50%的成纖維細胞同時表達成纖維細胞(Fsp1和α-SMA)和ECs(CD31)標志基因，提示ECs是腎纖維化過程中肌成纖維細胞的重要來源。隨后，LI等[9]利用ECs特異性遺傳示蹤小鼠結(jié)合共聚焦顯微鏡同樣發(fā)現(xiàn)約有10.4%～23.5%的肌成纖維細胞來源于ECs， 進一步證實ECs可通過直接轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞而促進腎纖維化進程。然而，近期的一項單細胞測序研究顯示，在人和小鼠CKD疾病中，肌成纖維細胞主要來源于特定的血管周細胞以及成纖維細胞亞群，而ECs、腎小管上皮細胞等來源的肌成纖維細胞占比較低。此外，與周細胞分泌的ECM量相比，ECs來源的ECM較少，表明ECs通過轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞進而分泌ECM調(diào)控腎纖維化進展[4]，但此種說法仍然需要進一步證實。

EndMT除了引起ECs命運發(fā)生改變以外，更關(guān)鍵的是導(dǎo)致ECs結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變[10]。在EndMT過程中，ECs中多種細胞間連接分子如VE-cadherin、ZO-1等表達下降，引起血管通透性增強、滲漏增加，血液灌流能力減弱，從而加重組織缺氧[7,10-11]，引發(fā)細胞大量死亡，破壞腎臟組織結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。在此過程中，ECs可分泌大量炎性因子如IL-6、TNF-α、IL-1β，引起免疫細胞浸潤，局部免疫應(yīng)答加重，進一步促進纖維化進展[7]。此外，EndMT來源細胞因子可直接作用于腎小管上皮細胞，進而調(diào)控腎纖維化進程。近期研究顯示，EndMT來源上清可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，阻斷EndMT可進一步減輕腎小管上皮細胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，減緩腎纖維化進程，表明EndMT過程中EC分泌能力改變是其加重纖維化進程的重要原因[12]。

近期，LOVISA等[7]用Rosa26-LSL-EYFP遺傳修飾小鼠進行譜系追蹤實驗，進一步證實小鼠腎纖維化進程中存在EndMT，特異性敲除調(diào)控EndMT的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail1和Twist1可有效抑制腎纖維化中EndMT轉(zhuǎn)變，減少膠原沉積，改善組織缺氧，進而有效維持腎小管上皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能，改善腎纖維化進程。以上研究表明抑制EndMT是治療腎纖維化等疾病的重要策略，對于其調(diào)控信號通路及下游分子的研究具有重要的理論意義和臨床價值。

2 多種信號通路及分子參與調(diào)控EndMT影響腎纖維化進展

ECs接受外界刺激后可活化或抑制細胞內(nèi)的多種信號通路及分子，進而產(chǎn)生增殖、遷移以及命運轉(zhuǎn)變等多種生物學(xué)行為，參與調(diào)控腎纖維化等疾病進程。已有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、Notch、Wnt信號通路，缺氧以及細胞內(nèi)的miRNAs在調(diào)控EndMT影響腎纖維化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，本部分內(nèi)容將逐一對這些信號通路及分子的作用及機制進行介紹。

2.1 TGF-β信號通路

TGF-β屬于轉(zhuǎn)化生長因子多功能超蛋白家族成員之一。在腎纖維化過程中，腎小管上皮、間質(zhì)細胞及ECs來源的TGF-β與成纖維細胞等細胞表面的TGFR2結(jié)合，活化下游的Smad信號通路，激活肌成纖維細胞及ECM的分泌，影響腎纖維化進程[5]。體內(nèi)、外研究表明TGF-β信號通路可通過上調(diào)Snail1和Slug等EndMT相關(guān)分子水平進而抑制ECs標志分子，如CD31及VE-cadherin的表達，同時上調(diào)間質(zhì)樣標志物如SM22α、α-SMA等的表達，促進EndMT及腎纖維化進展[7,13-14]。TGF-β/Smads信號通路是調(diào)控腎纖維化的中樞信號通路，將其阻斷可抑制EMT和EndMT，延緩纖維化[13-15]。特異性敲除ECs中的TGFR2可下調(diào)下游Smad2及Smad3信號通路，能夠在抑制EndMT的同時改善血液灌流及組織缺氧[15]。此外，Smad2的條件性敲除可顯著抑制腎小管上皮細胞樣改變及成纖維細胞標志物的表達，從而減輕腎纖維化程度[16]。近期研究顯示，敲除ECs中Sirt3可導(dǎo)致EndMT發(fā)生，進而分泌IL-1β等細胞因子，活化腎小管上皮細胞中TGF-β/Smad3信號通路，促進腎小管上皮細胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，加重腎纖維化進程[12]。體內(nèi)給予Smad3抑制劑SIS3抑制Smad3磷酸化可以阻斷EndMT發(fā)生，顯著減輕糖尿病性腎病和梗阻性腎病引起的腎纖維化進程[17]。

以上研究表明，阻斷TGF-β信號通路可用于治療纖維化相關(guān)疾病。目前，已有中和抗體、反義寡脫氧核苷酸以及小分子抑制劑等多種藥物靶向抑制TGF-β信號通路的藥物用于治療腎纖維化。吡非尼酮是TGF-β信號通路的小分子抑制劑，可有效改善腎小球過濾率和間質(zhì)纖維化，緩解糖尿病性腎病及腎小球硬化癥[18]。鈣核糖核酸是直接靶向TGF-β信號通路的天然抗體，研究顯示該抗體可用于改善單側(cè)輸尿管梗阻和糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維化[19]。VOELKER等[20]利用人源化抗TGF-β1中和抗體治療2型糖尿病性腎病的臨床試驗結(jié)果顯示阻斷該通路對緩解糖尿病性腎病的進程無明顯療效，并未明顯改善蛋白尿、腎小球過濾率以及血清肌酸酐等指標。目前TGF-β信號通路抑制劑的作用廣泛，但這些抑制劑有較強的副作用，表現(xiàn)為治療的同時產(chǎn)生消除抗炎和抗腫瘤的效應(yīng)，致使該治療策略在臨床研究中仍存在較大爭議。因此，靶向TGF-β信號通路治療腎纖維化相關(guān)疾病仍需要更加謹慎且細致的評估。

2.2 Notch信號通路

Notch信號通路主要介導(dǎo)相鄰細胞間相互作用，哺乳動物中有4種Notch受體(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)和5種配體(Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4和Jagged1，Jagged2)[8,21]。研究表明，Notch信號可通過調(diào)控EndMT進而影響組織發(fā)育及疾病進展，如在心臟發(fā)育中，Notch信號通路缺失阻止ECs發(fā)生EndMT，可引起心臟瓣膜形成異常[22]。在腎纖維化中，腎小管上皮細胞中Notch信號通路相關(guān)的受體、配體以及下游靶基因表達水平顯著上調(diào)。活化的Notch信號通路一方面促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，另一方面通過促進腎小管上皮細胞分泌多種細胞因子促進炎癥浸潤以及肌成纖維細胞活化。此外，Notch信號通路活化可激活腎小球系膜細胞中TGF-β/Smad信號通路，促進腎纖維化進展[23]。特異性阻斷腎小管上皮細胞中Notch信號通路以及使用γ-分泌酶抑制劑全身性阻斷Notch信號通路可顯著降低腎纖維化程度，緩解疾病進程[24]。在ECs中，WANG等[25]發(fā)現(xiàn)尿毒癥小鼠腎臟ECs中Notch信號通路明顯活化，同時表達間質(zhì)標志物Fsp-1和α-SMA的ECs顯著增加，EndMT增強。特異性敲除ECs中RBP-J阻斷Notch信號通路顯著改善腎臟血管結(jié)構(gòu)、功能以及炎癥細胞浸潤，進而緩解尿毒癥進程，提示Notch信號通路可通過調(diào)控EndMT影響腎纖維化進展[25]。近期，ZHAO等[26]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9可通過上調(diào)ECs中的Notch信號通路，促進EndMT進而加重腎纖維化進程，阻斷ECs中Notch信號通路可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9引起的EndMT[26]。目前，ECs中的Notch信號通路是否通過影響EndMT參與調(diào)控腎纖維化進展仍缺少直接的遺傳學(xué)證據(jù)，尋找Notch信號通路天然拮抗劑仍需要更加深入的探究。

2.3 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt信號通路由一組高度保守、分泌型的信號糖蛋白組成，通過調(diào)控炎癥、纖維化、血管生成和胰島素分泌等多種方式參與腎臟的損傷和修復(fù)。哺乳動物中共有19種Wnt蛋白，其中有16種Wnt蛋白參與調(diào)控不同損傷類型的腎臟疾病[27]。在正常成人腎臟中Wnt/β-catenin信號通路活化較弱[28]，然而，在短期急性腎損傷中，Wnt信號通路會被激活，進而促進腎組織再生和修復(fù)，但是過量以及持續(xù)的信號通路活化會導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone, RAAS)的不可逆激活、炎癥反應(yīng)和細胞外基質(zhì)沉積，發(fā)揮相反的作用[29]。研究表明，Wnt信號通路的大部分配體在纖維化腎的小管上皮細胞中表達，包括Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt9b和Wnt10b等[30]，其他細胞類型中也有少量表達。在高糖以及STZ誘導(dǎo)的糖尿病性腎病模型中，Wnt蛋白及其下游β-catenin表達水平顯著升高，相反，給予胰島素降低血糖濃度可抑制Wnt信號通路活化，表明Wnt信號通路參與調(diào)控腎纖維化相關(guān)疾病[31]。Wnt配體結(jié)合腎小管上皮細胞以及ECs膜表面受體后，促進β-catenin入核并上調(diào)Snail1和Twist等EMT及EndMT相關(guān)基因表達[31]，促進纖維化進展。在多種CKD動物模型中體內(nèi)注射Wnt/β-catenin信號通路或低密度脂蛋白相關(guān)受體抑制劑阻斷Wnt/β-catenin信號通路，可以抑制纖維化相關(guān)基因的表達，減少腎臟損傷部位fibronectin以及α-SMA的表達，延緩腎纖維化進程。近期，WANG等[32]報道Wnt/β-catenin介導(dǎo)LncRNA MALAT1參與動脈粥樣硬化中的EndMT過程，過表達miR-222靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制EndMT過程，表明阻斷Wnt信號通路可緩解EndMT相關(guān)疾病。KUANG等[33]報道靶向抑制miR-21或選擇性抑制Wnt/β-catenin信號通路，可通過恢復(fù)腎功能和減輕腎纖維化，減輕CKD的轉(zhuǎn)歸和進展。靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路已成為臨床上治療腎纖維化等相關(guān)疾病的重要潛在靶點[31]。研究表明，外源性Wnt抑制劑ICG-001能減少蛋白尿、血肌酐和血尿素氮，抑制腎組織纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和β-catenin的積累，抑制其下游靶基因RAAS等表達，抑制炎癥，可有效改善腎纖維化進程[34]。目前，Wnt信號通路通過調(diào)控EndMT影響腎纖維化進程仍缺乏直接的遺傳證據(jù)，未來應(yīng)利用細胞特異性遺傳修飾小鼠結(jié)合單細胞測序等高通量手段對Wnt信號通路的作用靶點及機制進行更加深入的研究，以期更好地解析Wnt信號通路在腎纖維化過程中的細胞和分子機制，為未來開發(fā)針對該通路的治療策略提供理論和實驗依據(jù)。

2.4 微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)

miRNAs是一類高度保守的小非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，主要通過結(jié)合靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)進而抑制靶基因翻譯，導(dǎo)致靶基因蛋白水平下降，進而調(diào)控細胞增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程。目前，已有多種miRNAs被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控EndMT影響腎纖維化等疾病進程[35]。GHOSH等[36]利用miRNAs陣列分析發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路誘導(dǎo)EndMT過程中伴隨多種miRNAs表達水平的改變，如miR-125b、miR-30、miR-let-7c、miR-let-7g、miR-21、miR-30b以及miR-195等表達水平顯著升高；相反，miR-122a、miR-127、miR-196以及miR-375等的表達水平明顯下調(diào)。隨后的研究證實miRNAs可通過調(diào)控EndMT進而影響腎纖維化進程，如miR-29家族直接靶向抑制TGF-β信號通路下游分子Smad3表達水平，進而阻斷TGF-β信號通路活化，抑制EndMT和EMT過程[37]，體內(nèi)遞送miR-29模擬物可有效緩解腎纖維化進程。尾靜脈注射含有miR-146s的聚乙烯亞胺納米顆粒至UUO腎纖維化小鼠體內(nèi)，可通過抑制TGF-β1和NF-κB信號通路活化進而減少腎纖維化[38]。近期，JORDAN等[39]發(fā)現(xiàn)miR-126-3p在EndMT以及腎纖維化過程中表達降低，miR-126-3p過表達抑制EndMT，提示miR-126-3p可作為治療EndMT相關(guān)纖維化疾病的靶點。我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，Notch信號下游的miR-342-5p可通過靶向抑制Endglin蛋白翻譯進而調(diào)控TGF-β信號下游Smad通路促進EndMT，表現(xiàn)為ECs中間質(zhì)樣標志基因α-SMA、Vimentin等表達顯著上調(diào)，而ECs標志基因CD31、VE-cadherin等表達顯著下調(diào)[40]。

盡管多數(shù)miRNAs與CKD疾病間的細胞與分子相關(guān)機制仍需要進一步深入闡明，但其作為腎臟疾病的治療靶點和生物標志物已得到越來越多關(guān)注。近年來，已有多種miRNAs相關(guān)藥物正在或即將進行臨床試驗。如以miR-21為靶點的藥物RG-102(anti-miR-21)已經(jīng)進入二期臨床試驗。RG-102由Regulas Therapeutics公司開發(fā)，主要用于Alport腎病的治療。此外，以miR-29模擬物為基礎(chǔ)開發(fā)的miRNA藥物Remlarsen也已進入臨床試驗階段，并且有望成為治療腎纖維化等疾病的重要手段[41]。此外，與miRNAs相關(guān)藥物在腎臟領(lǐng)域獲得極大關(guān)注，如DPP-4抑制劑利格列汀可通過誘導(dǎo)miR-29抑制EndMT，同時減輕與DPP-4相關(guān)的糖尿病腎纖維化[42]。miRNAs除了作為治療靶點應(yīng)用于臨床以外，還具備穩(wěn)定性強、靈敏度高以及易檢測等優(yōu)點，可作為生物標志物用于疾病診斷。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p在IgA腎病患者尿液中表達顯著高于健康對照組，提示該miRNA可作為IgA腎病的早期診斷指標以及治療靶點[43]。近期，DONDERSKI等[44]利用實時定量PCR技術(shù)檢測了45例CKD患者以及17例健康對照人員的尿液和血液中miRNAs表達情況，結(jié)果顯示miR-29-5p、miR-21-5p以及miR-196a-5p等在CKD患者中表達顯著升高，而miR-155-5p、miR-214-5p、miR-200a-5p以及miR-93-5p等在CKD患者尿液和血液中表達顯著降低，提示這些miRNAs可作為CKD潛在的診斷指標。隨著脂質(zhì)體或納米顆粒等新載體藥物遞送系統(tǒng)以及高通量檢測技術(shù)的不斷革新，未來以miRNAs作為腎纖維化等疾病的治療靶點和生物標志物將越來越多地被應(yīng)用于臨床。

3 結(jié)語

越來越多的研究表明，ECs在多種因素作用下可發(fā)生EndMT進而通過多種方式調(diào)控腎纖維化等疾病進程，阻斷EndMT可有效緩解疾病進展，是治療纖維化相關(guān)疾病的重要靶點，因此，對其調(diào)控機制的研究至關(guān)重要。前期研究顯示，除了本文介紹的TGF-β、Notch、Wnt以及miRNAs等信號通路外，還有MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT以及l(fā)ncRNA等多種信號通路和分子調(diào)控EndMT影響腎纖維化進程[31]，這些信號通路及分子間存在相互調(diào)控共同維持腎臟等組織器官穩(wěn)態(tài)，如本課題組前期發(fā)現(xiàn)Notch信號通路一方面可通過下游miR-342-5p調(diào)控ECs中TGF-β信號通路，另一方面還可調(diào)控ECs中Wnt蛋白表達和分泌，進而影響組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。隨著單細胞組學(xué)技術(shù)以及其他高通量手段的廣泛應(yīng)用，未來探究ECs命運和功能可塑性在腎纖維化等疾病中的作用及機制將會越來越細致化，進而為腎臟疾病的臨床治療提供更加可行的策略和靶點。