楊佩璇，陳一村

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)病機(jī)制不明的多關(guān)節(jié)慢性炎癥性疾病.中醫(yī)藥治療RA在于改善癥狀體征及關(guān)節(jié)功能障礙，進(jìn)而提高生活質(zhì)量[1].目前中藥在治療RA上也有一定的療效.桑白皮為?？粕僦参锏母稍锔ど＃ɡW(xué)名：Morus alba L.），其藥理作用有鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)咳、平喘、降血糖、降脂、抗糖尿病周?chē)窠?jīng)病變作用等[2].桑白皮總黃酮對(duì)小鼠醋酸所致的外周疼痛和急性炎癥期有明顯的抑制作用[3].韋寧等[4]收集古醫(yī)籍及現(xiàn)代醫(yī)家臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桑白皮配伍桑葉、桑枝、黃芩、麻黃、連翹、赤小豆等可治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[4].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥活性成分、作用靶點(diǎn)及其機(jī)制研究中的應(yīng)用方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)桑白皮治療RA的靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

表1 實(shí)驗(yàn)所用的數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

1.2 桑白皮活性成分及靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）中，以“sangbaipi”為關(guān)鍵詞，查找桑白皮的所有化學(xué)成分.桑白皮的主要活性成分以口服生物利用度（0B）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18作為篩選條件收集出來(lái)，并在此數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出其主要活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，將靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱用STRING或Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)查找獲得.

1.3 RA靶點(diǎn)的獲取

以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞分別在人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，根據(jù)一定的條件篩選出類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的基因，整合并刪除重復(fù)值.

1.4 桑白皮治療RA的活性成分網(wǎng)絡(luò)分析

桑白皮與RA的共同靶點(diǎn)通過(guò)在線韋恩圖繪制平臺(tái)進(jìn)行計(jì)算，并將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)繪制成圖.用Cytoscape軟件構(gòu)建出交集靶點(diǎn)與疾病、藥物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并通過(guò)分析相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)來(lái)推測(cè)桑白皮發(fā)揮治療RA作用的可能成分.

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

將上述“1.4”項(xiàng)下兩者交集的靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“多種蛋白質(zhì)”和物種“人”，其余不變.導(dǎo)出得到的蛋白相互作用圖的相關(guān)數(shù)據(jù)，并利用Cytoscape3.8.2進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化.

1.6 生物功能與通路富集分析

將得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)本研究獲取的桑白皮治療RA的關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology，基因本體論）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書(shū)）通路富集分析.以P＜0.01作為篩選條件，得到的分析結(jié)果用微生信在線繪圖平臺(tái)進(jìn)行可視化.

1.7 潛在作用靶點(diǎn)與關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從“1.6”項(xiàng)獲得參與RA的20條KEGG通路后，與中藥、成分、共同靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，并將其共同輸入到Cytoscape3.8.2軟件中，構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系.

2 結(jié)果

2.1 桑白皮活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）搜集桑白皮所有化學(xué)成分194個(gè)，根據(jù)“1.2”項(xiàng)下的篩選條件得到桑白皮的潛在活性成分有31個(gè)，見(jiàn)表2.

表2 桑白皮主要化學(xué)成分信息

2.2 桑白皮成分抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP中將桑白皮31個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)查找出來(lái)，并在Uniprot、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)將其基因標(biāo)準(zhǔn)化，剔除重復(fù)和無(wú)效靶點(diǎn)后，得到有效靶點(diǎn)基因190個(gè).在GeneCards、DisGeNET中檢索RA的作用靶點(diǎn)，整合后并剔除重復(fù)值，得到RA疾病的作用靶點(diǎn)647個(gè).利用在線韋恩繪制平臺(tái)繪制韋恩圖并得到桑白皮治療RA的交集靶點(diǎn)有 38個(gè)，如圖 1，分別為 NOS2，PTGS1，AR，PPARG，PTGS2，PIK3C，ESR1，SCN5A，NFKBIA，HSPA5，MYC，GJA1，IL1B，CXCL8，IL2，COL1A1，PTEN，MPO， COL3A1， MAPK14， NR3C1， IKBKB， TNF， MMP1， ICAM1， VCAM1，MMP3， FOS， MMP9， MAPK1， IL6， TP53， CXCL2， CRP， CXCL10， SPP1，RUNX2，CD40LG.這些靶點(diǎn)可能是桑白皮發(fā)揮治療RA的主要基因靶點(diǎn).

圖1 桑白皮有效成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 活性成分關(guān)鍵靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

桑白皮與RA作用靶點(diǎn)相關(guān)的藥物活性成分有21個(gè)，將活性成分、中藥與疾病共同的關(guān)鍵靶點(diǎn)用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖2.圖中，菱形代表桑白皮的有效成分，圓形代表作用靶點(diǎn).網(wǎng)絡(luò)顯示，藥物活性成分連接值在前5的為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、Glabrone（光甘草酮）、Moracin D（桑辛素D）、Iristectorigenin（9CI）（鳶尾黃酮甲素（9CI））.上述成分可能是桑白皮治療RA的重要活性成分，在治療RA中具有重要意義.

圖2 桑白皮“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 共有蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將桑白皮與RA交叉的38個(gè)靶基因上傳至STRING平臺(tái)，物種設(shè)定為“Human”根據(jù)高級(jí)篩選條件“high confidence（0.4）”進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，即最低要求交互分?jǐn)?shù)為0.4，檢索得到PPI網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件繪制出桑白皮-RA關(guān)聯(lián)的蛋白交互的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3.由圖3可得，此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)38個(gè)，邊411個(gè).圖中節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與靶點(diǎn)間連線有關(guān)，連線越多，節(jié)點(diǎn)越大，度值越大；節(jié)點(diǎn)的顏色從黃色到深藍(lán)色，相應(yīng)的度值也逐漸變大.結(jié)果提示，桑白皮對(duì)抗RA的靶標(biāo)中Degree值最高的靶點(diǎn)TNF、IL6、IL1B、PTGS2、TP53、MMP9、CXCL8、NFKBIA、PPARG、VCAM1，度值分別為36、35、34、33、33、32、30、28、27、26.這可能是桑白皮治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖3 “藥物-疾病”交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

在GO功能分析結(jié)果中，在P＜0.01基礎(chǔ)上選取生物過(guò)程（Biological Processes，BP）、分子功能（Molecular Functions，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）富集基因數(shù)目前10的生物學(xué)過(guò)程，利用微生信平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理得到柱狀圖，如圖4，顯示桑白皮對(duì)RA的治療作用主要與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外液、蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等相關(guān).

圖4 桑白皮治療RA的GO生物過(guò)程

對(duì)38個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選P＜0.01，選擇富集前20的通路為候選通路，主要涉及到脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、癌癥通路、IL-17信號(hào)通路等信號(hào)通路.將上述信號(hào)通路利用微生信平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后得到氣泡圖，如圖5.

圖5 桑白皮治療RA的KEGG通路

2.6 藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將關(guān)鍵信號(hào)通路與桑白皮治療RA的潛在作用靶點(diǎn)及藥物的活性成分進(jìn)行一一映射，利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，如圖6，藍(lán)色圓形代表靶點(diǎn)基因，橙色菱形代表通路，黃色正方形代表藥物活性成分，紫色V字形代表藥物桑白皮.從網(wǎng)絡(luò)連接值的分析結(jié)果可知，桑白皮治療RA的機(jī)制可能是藥物中的 quercetin、kaempferol、Glabrone、Moracin D、Iristectorigenin（9CI）等有效成分通過(guò)MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、FOS、CXCL8、IL1B等關(guān)鍵靶點(diǎn)，作用于脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、癌癥通路、IL-17信號(hào)通路等通路，從而發(fā)揮治療作用.

圖6 藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮的抗炎作用顯著，而RA的發(fā)病機(jī)制可能與免疫細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、氧化應(yīng)激異常、遺傳和生存環(huán)境因素等有關(guān)[5].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的問(wèn)世為中藥作用于疾病的機(jī)制研究提供了一種新的方法和思路，它能夠從整體聯(lián)系到微觀，從多個(gè)層面系統(tǒng)地分析分子作用機(jī)制[6].

通過(guò)分析桑白皮有效成分顯示，桑白皮主要通過(guò)21個(gè)活性成分對(duì)RA進(jìn)行干預(yù)治療，從網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果中可以得出度值排名靠前的有槲皮素、山奈酚、鳶尾黃酮甲素（9CI）、桑辛素D、光甘草酮等.這些成分也是桑白皮治療RA的關(guān)鍵成分.葉香蘭等研究認(rèn)為槲皮素具有多種生物學(xué)活性，如抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和分泌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制滑膜細(xì)胞的增殖等，可以抑制RA的病理過(guò)程[7].另有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過(guò)抑制核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，減少炎癥條件下軟骨細(xì)胞中MMP-13的產(chǎn)生、基質(zhì)降解和凋亡來(lái)保護(hù)軟骨[8].對(duì)于山奈酚，有研究者[9]通過(guò)體外和CIA小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)山奈酚降低了RA成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）的遷移、侵襲和MMP表達(dá)，還明顯的抑制了腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，并且減輕了CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度.Lin等[10]研究揭示了山奈酚可預(yù)防和治療RA、紅斑性狼瘡和強(qiáng)直性嵴柱炎等炎癥性疾病.鄒桂欣等研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃酮甲素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立的細(xì)胞炎癥反應(yīng)中NO的生成量均有顯著抑制作用，進(jìn)而表明其抗炎作用的相關(guān)關(guān)系[11].康艷賓等研究證實(shí)桑辛素對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡基因表達(dá)量有抑制作用[12].這說(shuō)明桑白皮可能通過(guò)這些關(guān)鍵成分來(lái)發(fā)揮治療RA的作用.

從藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果得到，桑白皮的活性成分可能作用于MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、IL1B等網(wǎng)絡(luò)連接較多的靶點(diǎn)，而這些靶點(diǎn)可能是治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn).如在免疫介導(dǎo)的RA的三個(gè)病理過(guò)程：炎癥、增殖和骨破壞中，MAPK起著重要的調(diào)節(jié)作用[13].有研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAPK14抑制劑可幫助治療RA和其他慢性炎癥性疾病，同時(shí)具有靶向抑制MAPK14的化合物也應(yīng)用到治療RA當(dāng)中[14].尚華等[15]通過(guò)生物信息學(xué)分析RA作用機(jī)制可能包括調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-17等）分泌和免疫細(xì)胞（如Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、破骨細(xì)胞等）分化，調(diào)控自噬通路.而腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種在RA發(fā)病機(jī)制中起重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子.可見(jiàn)在桑白皮治療RA機(jī)制中，這些靶點(diǎn)可能起到關(guān)鍵作用.

在KEGG分析中顯示，桑白皮治療RA的作用機(jī)制主要通過(guò)脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、癌癥通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路.如王志會(huì)等通過(guò)研究分析脂質(zhì)代謝紊亂及內(nèi)皮功能異常在RA患者早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中認(rèn)為炎癥與脂代謝紊亂互為因果，氧化修飾型低密度脂蛋白可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、TNF-α等致炎因子[16].TNF-α與TNF受體結(jié)合，能夠引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控目的基因的表達(dá)，造成炎癥反應(yīng)和骨關(guān)節(jié)損傷[17].IL-17的致炎性很強(qiáng)，在RA的發(fā)病過(guò)程中有著重要作用，IL-17信號(hào)通路可激活多條通路如NF-κB、JNK等，呂芳[18]通過(guò)觀察Actl基因表達(dá)下降后IL-17誘導(dǎo)的IL-6和IL-8表達(dá)的變化，驗(yàn)證了其參與了RA的發(fā)病.以上這些通路大多被證實(shí)對(duì)治療RA具有一定的調(diào)控作用.

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)桑白皮治療RA的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其發(fā)揮作用途徑涉及到多個(gè)成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路，但關(guān)鍵途徑的調(diào)控仍要深入研究，后續(xù)將通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證.