楊蘭，秦雪梅，徐勝，紀(jì)建軍，李文成，李震宇*

（1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.廣盛原中醫(yī)藥有限公司，山西 大同 037300）

0 引言

芪參補氣膠囊原名芪皇膠囊，由黃芪、白術(shù)（炒）、防風(fēng)、西洋參4味藥材制成，具有益氣固表作用，用于反復(fù)外感引起的自汗易感，氣短乏力，少氣懶言等肺氣虛證。該組方在玉屏風(fēng)散基礎(chǔ)上增加益氣養(yǎng)陰的西洋參，不僅強化了補氣功效，而且西洋參的涼性可以中和黃芪的燥性，適合兒童和成人疾病后期氣陰兩傷的情況下使用。已有臨床研究顯示該藥對181例肺衛(wèi)氣虛、免疫功能低下的上呼吸道反復(fù)感染患者的總改善率為89.5%［1］；對120例肺氣虛證病人的臨床總有效率為96.7%，明顯高于對照組玉屏風(fēng)顆粒（85%）［2］。在多個版本的新冠肺炎治療方案中，經(jīng)典名方玉屏風(fēng)散被廣泛推薦用于醫(yī)務(wù)工作者、密切接觸人員和易感人群的日常預(yù)防。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了多門新型學(xué)科，對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，在維持網(wǎng)絡(luò)平衡的基礎(chǔ)上，全面系統(tǒng)的研究藥物、靶點與疾病之間的關(guān)系和作用機制［3］。本文擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析芪參補氣膠囊增強機體免疫力相關(guān)的靶點，通過構(gòu)建藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)預(yù)測成分與靶點之間的作用關(guān)系，結(jié)合GO（Gene Ontology)功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）通路富集分析，推測其發(fā)揮作用的生物學(xué)途徑，為進(jìn)一步闡明芪參補氣膠囊增強免疫力的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芪參補氣膠囊化學(xué)成分信息的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別以“防風(fēng)”“白術(shù)”“西洋參”“黃芪”為關(guān)鍵詞檢索，篩選出OB值（口服生物吸收度）≥30%、DL值（類藥性）≥0.18的化學(xué)成分［4］。利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索各中藥成分的化學(xué)信息，下載化合物的各成分sdf格式。

1.2 芪參補氣膠囊與免疫力有關(guān)的靶標(biāo)預(yù)測

在數(shù)據(jù)庫 GenCLiP3（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）和 GeneCard（https：//www.genecards.org/）中以“immunity”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，得到與免疫力相關(guān)的基因，去掉重復(fù)基因構(gòu)建疾病靶點庫。再將芪參補氣膠囊中每味藥材的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)和信息輸入數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）中進(jìn)行靶點預(yù)測，兩個數(shù)據(jù)庫中篩選得到的靶點去重后，得到芪參補氣膠囊潛在作用靶點數(shù)據(jù)庫。將芪參補氣膠囊靶點庫和疾病靶點庫對比映射，得到重復(fù)靶點作為芪參補氣膠囊與免疫力相關(guān)的作用靶點。

1.3 藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.1軟件將藥材、主要成分、靶點和前20條通路進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，構(gòu)建藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，通過網(wǎng)絡(luò)圖直觀展示主要成分與潛在作用靶點之間的關(guān)系，并分析主要成分和靶點間的度（degree）和中介度（betweenness centrality）。某節(jié)點相連的邊數(shù)用節(jié)點的度值表示，節(jié)點大小正比于度值；網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)過某一節(jié)點最短路徑的數(shù)目占該網(wǎng)絡(luò)中路徑總數(shù)的比例用中介度表示，來反映此節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中的影響程度。度和中介度值越大的節(jié)點，則在網(wǎng)絡(luò)中影響程度越大［5］。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）是用于較為直觀地反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的平臺，其相關(guān)數(shù)據(jù)主要通過實驗操作，計算預(yù)測方法等途徑獲得［6］。將芪參補氣膠囊與增強免疫力相關(guān)的靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，物種限定為“Homo sapiens”，獲取靶點的內(nèi)在互作關(guān)系，同時通過Cytoscape 3.7.1軟件對靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行構(gòu)建。設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點大小反映度，顏色冷暖代表其中介度，連線的粗細(xì)反映結(jié)合律評分（Combine score）。

1.5 靶點通路分析

DAVID是免費的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫，囊括了眾多生物學(xué)知識以及分析工具，通過從大批量的基因和蛋白中選取有價值的生物學(xué)信息，對基因功能和通路富集分析，包含著多種的基因標(biāo)識符的DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）能夠?qū)Χ喾N多樣的基因集合進(jìn)行處理［7］。將芪參補氣膠囊與增強免疫力相關(guān)的靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，再應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件中ClueGo及CluePedia插件對芪參補氣膠囊與增強免疫力相關(guān)的靶點進(jìn)行GO功能的免疫系統(tǒng)過程分析，并構(gòu)建靶點-免疫系統(tǒng)過程網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 芪參補氣膠囊化學(xué)成分信息的收集

TCMSP中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺中獲取，輸入關(guān)鍵詞“防風(fēng)”“白術(shù)”“西洋參”“黃芪”，得到活性成分信息，并利用PubChem數(shù)據(jù)庫對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。得到符合OB≥30%和DL≥0.18的化學(xué)成分共39個。雖然黃芪中部分成分（黃芪皂苷I、II、III、IV、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、異黃烷）、白術(shù)中部分成分（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮）、防風(fēng)中部分成分（亥茅酚、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻苷）以及西洋參中部分成分（人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1）OB或DL值不符合要求，但這些成分均是這4個藥材中重要的活性成分，因此也納入后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。最終納入成分包括，白術(shù)11個，防風(fēng)22個，西洋參16個，黃芪10個（表1）。

表1 芪參補氣膠囊中各藥材的化合物信息Table 1 Compound information of various medicinal materials in Qishen Buqi Capsule

續(xù)表1 芪參補氣膠囊中各藥材的化合物信息Continue Table 1 Compound information of various medicinal materials in Qishen Buqi Capsule

2.2 作用靶點的獲取以及中藥-主要成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、BATMANTCM數(shù)據(jù)庫收集到的芪參補氣膠囊主要成分作用靶點，與數(shù)據(jù)庫GenCLiP 3和GeneCard數(shù)據(jù)庫篩選出的與免疫力相關(guān)的靶點進(jìn)行映射，得到109個共有靶點，確定為芪參補氣膠囊中主要成分作用與免疫力增強有關(guān)的靶點。

采用Cytoscape 3.7.1軟件建立芪參補氣膠囊的藥材-主要成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），共有164個節(jié)點，包括藥材節(jié)點4個、主要成分節(jié)點51個、靶點節(jié)點109個以及876條連線，其中藥材表示為橙色菱形，主要成分表示為V字形（白術(shù)主要成分表示為黃色V字形，黃芪主要成分表示為綠色V字形，防風(fēng)主要成分表示為藍(lán)色V字形，西洋參主要成分表示為粉色V字形，防風(fēng)和西洋參相同成分表示為紅色V字形），藥物靶點表示為紫色長方形；節(jié)點之間的連線代表其相互作用。由圖1可知，同一成分可以作用于不同靶點，如divaricatol可以作用于MAPK1、KDR等24個靶點，calycosin-7-O-β-D-glucoside可以作用于TNF、IL2等24個靶點，而同一靶點也可對應(yīng)不同化學(xué)成分，如IL2對應(yīng)formononetin、calycosin等12個成分。每味藥材度值排名靠前的成分有g(shù)insenoside rh2（人參皂苷rh2）、PQ-2、calycosin-7-O-β-D-glucoside（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、astragaloside IV（黃芪皂苷IV）、divaricatol、wogonin（漢黃芩素）、atractylenolide Ⅱ（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）、atractylenolide Ⅲ（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ），共8個成分。因此，芪參補氣膠囊通過多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮增強免疫力作用。

圖1 藥材-主要成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Medicine-compound-target network

2.3 PPI的網(wǎng)絡(luò)圖

對使用STRING網(wǎng)站得到的蛋白進(jìn)行分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2（a））中有109個節(jié)點，2146條連線（節(jié)點表示蛋白，每條連線則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系），網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點顏色反映度，節(jié)點顏色越深度越大，其中度排名前10位的節(jié)點包括TNF、VEGFA、AKT1、STAT3、ALB、MAPK3、SRC、HRAS、EGFR、IL2（網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖2（b））。提示這些靶點可能在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中起著較為關(guān)鍵的作用，可能是芪參補氣膠囊用來增強免疫力的關(guān)鍵靶點。

圖2 相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of related targets

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將相關(guān)作用靶點導(dǎo)入DAVID中進(jìn)行GO功能分析，共得到569個GO條目（P＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）占75%，主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）和凋亡過程負(fù)調(diào)控等通路；細(xì)胞組成（cell composition，CC）占10%，涉及細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、質(zhì)膜和核等通路；分子功能（MF）占15%，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、能量結(jié)合（ATP binding）和相同蛋白的結(jié)合等方面。各類別前20的通路具體信息如圖3所示。應(yīng)用ClueGo插件對芪參補氣膠囊與增強免疫力相關(guān)的靶點進(jìn)行GO功能的免疫系統(tǒng)過程分析，得到相關(guān)靶點與免疫系統(tǒng)過程的網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），圖中有74個節(jié)點分布于2個圓形軌道上，其中內(nèi)圈軌道上的節(jié)點代表芪參補氣膠囊與增強免疫力相關(guān)的靶點，有58個，外圈軌道上的節(jié)點代表免疫系統(tǒng)過程，有16個，主要涉及B細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞分化、白細(xì)胞分化、骨髓白細(xì)胞分化、T細(xì)胞平衡等過程，對應(yīng)免疫系統(tǒng)過程節(jié)點的大小反映該免疫系統(tǒng)過程在涉及的所有免疫系統(tǒng)過程中的比例；圖中有273條連線代表靶點與免疫系統(tǒng)過程的關(guān)系，連線越粗代表兩者關(guān)系越密切。

圖3 芪參補氣膠囊增強免疫力靶點的GO富集分析Fig.3 Analysis of GO enrichment of Qishen Buqi Capsule targets for improving immunity

圖4 靶點-免疫系統(tǒng)過程網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Target-immune system process network

KEGG通路富集篩選得到芪參補氣膠囊可能發(fā)揮作用的111條信號通路（P＜0.05），包括PI3KAkt signaling pathway、Hepatitis B、Proteoglycans in cancer等通路，前20條通路圖如圖5所示。圖中圓點的大小反映的是每條通路富集靶點的數(shù)目（GeneNumber），5條通路富集的靶點較多，包括Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Hepatitis B、Proteoglycans in cancer、HTLV-I infection。其中，Pathways in cancer富集靶點最多，共43個（占總靶點數(shù)量的39.4%），PI3K-Akt signaling pathway富集靶點28個（占總靶點數(shù)量的25.7%），Hepatitis B富集靶點27個（占總靶點數(shù)量的24.8%）。圓點的顏色反映的是P值（pvalue）大小，顏色越接近紅色，P值越小，基因的顯著性越高；越接近藍(lán)色，P值越大基因的顯著性越低，其中，Pathways in cancer的P值最?。?.53×10-26），Ras signaling pathway的P值最大（5.87×10-11）。

圖5 芪參補氣膠囊增強免疫力靶點的KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway target of Qishen Buqi Capsule for enhancing immunity

2.5 藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥材、成分、靶點和通路節(jié)點的相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），圖中包括184個節(jié)點，其中4個藥材節(jié)點、51個主要成分節(jié)點、109個靶點節(jié)點和20個通路節(jié)點以及1336條連線。藥材表示為橙色菱形，主要成分表示為V字形，（白術(shù)主要成分表示為黃色V字形，黃芪主要成分表示為綠色V字形，防風(fēng)主要成分表示為藍(lán)色V字形，西洋參主要成分表示為粉色V字形，防風(fēng)和西洋參相同成分表示為紅色V字形），藥物靶點表示為紫色長方形，前20條通路表示為墨綠色六邊形；節(jié)點間的連線代表其相互作用。

圖6 藥材-主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Medicine-compound-target-pathway network

2.6 芪參補氣膠囊各藥材的作用靶點分析

芪參補氣膠囊涉及增強免疫力的109個靶點中，黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、西洋參均各有貢獻(xiàn)（圖7，韋恩圖）。其中，黃芪涉及68個靶點和111條KEGG通路，特有的靶點有9個，分別是PON1、FGFR3、ALB、CD274、CCR3、BIRC5、SELL、MIF、BTK；白術(shù)涉及54個靶點和109條KEGG通路，特有的靶點有4個，分別是NOS3、IL1B、PGR、PTPRC；防風(fēng)的78個靶點對應(yīng)108條KEGG通路，特有的靶點有7個 ，分 別 是 PRF1、CASP1、VCAM1、PSEN1、CASP8、NLRP3、FCER2；西洋參涉及80個靶點和111條KEGG通路，特有的靶點有7個，分別是TLR7、CCR5、XIAP、STAT5B、STAT1、CX3CR1、PRTN3。芪參補氣膠囊在玉屏風(fēng)的基礎(chǔ)上增加了西洋參，因此，西洋參的這7個特有靶點是芪參補氣膠囊相對于玉屏風(fēng)散的特有靶點。

圖7 芪參補氣膠囊潛在靶點的Venn圖Fig.7 Venn diagram of potential target in Qishen Buqi Capsule

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析芪參補氣膠囊增強免疫力的作用機制，利用TCMSP平臺通過設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18兩個參數(shù)篩選各個藥材的主要成分，得到白術(shù)主要成分11個，防風(fēng)主要成分22個，西洋參主要成分16個，黃芪主要成分10個，所構(gòu)建的藥材-主要成分-靶點-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖由4個藥材節(jié)點、51個主要成分節(jié)點、109個靶點節(jié)點和20個通路節(jié)點組成。

與玉屏風(fēng)散相比，芪參補氣膠囊增加的7個特有靶點（TLR7、CCR5、XIAP、STAT5B、STAT1、CX3CR1、PRTN3）部分與免疫相關(guān)。研究顯示STAT5B缺乏或突變導(dǎo)致人類自然殺傷細(xì)胞成熟失調(diào)和裂解功能受損，也會損害T細(xì)胞體內(nèi)平衡，從而影響人體的自身免疫［8］。Majoros等發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）通過引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)到干擾素（IFNs），在天然免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用［9］。TLRs是一種膜型蛋白，被歸類為模式識別受體（PRRs），對天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)而引起廣泛關(guān)注，TLR7就是其中的一類受體［10］。

已有研究顯示漢黃芩素介導(dǎo)小鼠白細(xì)胞的細(xì)胞毒性，激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，可提高NK細(xì)胞的殺傷作用和巨噬細(xì)胞的吞噬作用。漢黃芩素可呈劑量依賴性增加白細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子IL-1α和TNF-α水平，增加IL-1α和TNF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，抑制NF-κB的p65和I-κB的表達(dá)［11］。唐冕等指出黃芪皂苷能促進(jìn)細(xì)胞吞噬功能和增加溶酶體水解酶含量，并增強處理和傳遞抗原的能力，抑制腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和TNF-α［12］。人參皂苷Rh2可提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能及血清溶血素抗體的生成能力，提高小鼠NK細(xì)胞殺傷活性和IL-2活性［13］。Gharibi等發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中，淋巴細(xì)胞表達(dá)的大多數(shù)細(xì)胞因子受體，包括IL-6、IL-10、IL-21、IL-23和干擾素（IFNs）的受體，都能激活STAT3。提示它是淋巴細(xì)胞生物學(xué)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和自身免疫的重要因素［14］。Zenke等發(fā)現(xiàn)AKT1是PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要效應(yīng)分子，通過抑制NF-κB激活和IRF3活性（獨立于其激酶活性），從而明顯抑制Toll樣受體（TLR）介導(dǎo)的MyD88依賴性信號傳導(dǎo)和Toll/IL-1R結(jié)構(gòu)域的適配器誘導(dǎo)的IFN-β（TRIF）依賴性信號傳導(dǎo)，從而抑制炎癥而提高自身免疫力［15］。Toll-like receptor（TLRs）通過識別病原體或病原體相關(guān)分子模式的保守成分，參與天然免疫反應(yīng)，TLRs在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中高度表達(dá)，樹突狀細(xì)胞是天然免疫反應(yīng)的主要參與者，也是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的主要發(fā)起者。因此，TLRs的激活是先天免疫反應(yīng)對入侵病原體的關(guān)鍵因素，但也指導(dǎo)隨后持續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的類型和程度［16］。Influenza A的信號被識別后，宿主細(xì)胞內(nèi)3種模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）介導(dǎo)的天然免疫信號通路被激活，這些通路調(diào)控宿主干擾素（IFN）等細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，從而分泌相關(guān)細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素。干擾素與相應(yīng)的干擾素受體結(jié)合，激活Janus酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子（Janus tyrosine kinasessignal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信號通路?；罨腏AK-STAT信號通路啟動一系列干擾素刺激基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)著機體的免疫功能［17］。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出的芪參補氣膠囊成分-靶點-通路之間的相互作用部分結(jié)果可以得到現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的確證。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從化學(xué)成分、作用靶點、信號通路的角度分析了芪參補氣膠囊增強免疫力的可能生物學(xué)機制，發(fā)現(xiàn)芪參補氣膠囊中的漢黃芩素、黃芪皂苷、人參皂苷Rh2等8個化合物，STAT3、AKT1、ALB等10個靶點，以及PI3K-Akt signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Influenza A等20條通路與芪參補氣膠囊的免疫增強作用密切相關(guān)，從而初步推測了芪參補氣膠囊是通過多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜作用機制而發(fā)揮作用，為進(jìn)一步深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制奠定了基礎(chǔ)。但是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果需要在后續(xù)研究中通過實驗進(jìn)行驗證。