隗正陽，安沛沛，吳洪啟，劉 樂，肖恩時，景 兵，王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

植物表皮蠟質(zhì)覆蓋在植物表皮細(xì)胞最外層，是由超長鏈脂肪酸及其衍生的醇、烷烴、醛、酮等組成的疏水性混合物，其主要功能是限制植物非氣孔水分流失，進(jìn)而提高植物抗旱性[1-3]。同時表皮蠟質(zhì)還可使植物免受紫外線傷害及減少植物表面空氣污染物的沉積，在植物育性、植物-病原菌互作方面也具有重要作用[4-7]。

植物葉表皮蠟質(zhì)的積累是植物體內(nèi)重要的生理過程，受環(huán)境脅迫的影響較為嚴(yán)重[8]。通常情況下，干旱和鹽脅迫能夠?qū)е氯~片蠟質(zhì)顯著增加。Kosma等[5]研究發(fā)現(xiàn)，干旱和鹽脅迫8d后擬南芥葉片蠟質(zhì)總含量分別增加了80%和75%；所有蠟質(zhì)組分中，烷烴含量增加最明顯，可分別增加98%和93%。這種變化與角質(zhì)層滲透性降低有關(guān)，并且可能有助于植物在水分缺失條件下生長。同樣，干旱脅迫后胡楊、鹽生水芹和番茄等植物葉片蠟質(zhì)明顯增加，而這種變化也是由烷烴組分含量增加導(dǎo)致[9-11]。以上研究表明，蠟質(zhì)組分中烷烴在植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫中起著重要作用。然而，烷烴作為植物表皮蠟質(zhì)的重要組成成分，其合成的具體機(jī)制仍不清楚[12-13]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和玉米(Zeamays)相應(yīng)突變體中的研究證明了CER1和CER3及其同源基因在烷烴合成中的重要作用，擬南芥中改變CER1(At1G02205)和CER3(At5G57800)的表達(dá)都直接影響其烷烴含量[7]。在豌豆(Pisumsativum)和藍(lán)藻(Cyanobacteria)的研究中證明烷烴的合成需要兩個步驟：首先脂酰輔酶A還原酶將脂酰輔酶A轉(zhuǎn)化為中間體醛，然后醛脫羰基酶催化中間體醛脫羰基生成烷烴[14-15]?；谒{(lán)藻中烷烴合成的步驟及擬南芥突變體表型的研究，CER1蛋白被認(rèn)為是一種催化醛脫羰基酶，而CER3蛋白被認(rèn)為是一種可以將脂酰輔酶A還原為醛的酶[6,7]。Bernard等[16]利用改造的酵母證明了CER1和CER3蛋白能夠相互作用形成二聚體酶復(fù)合物，并在輔助因子CYTB5的促進(jìn)作用下將脂酰輔酶A轉(zhuǎn)化為烷烴。

向日葵(HeliauthusannuusL.)是我國干旱、半干旱地區(qū)的重要油料作物，干旱、鹽脅迫能夠?qū)е孪蛉湛a(chǎn)量和種子含油量大幅下降，是限制向日葵生產(chǎn)的主要因素[17]。目前關(guān)于向日葵表皮蠟質(zhì)與干旱和鹽脅迫的研究鮮有報道，因此探究脅迫條件下向日葵表皮蠟質(zhì)的變化，挖掘表皮蠟質(zhì)相關(guān)合成基因的工作尤為必要。本研究擬分析向日葵葉片表皮蠟質(zhì)的組成及其在干旱和鹽脅迫下的變化，在向日葵基因組中檢索到6個烷烴合成候選基因，分析候選基因的組織表達(dá)譜，并在向日葵葉片中克隆其中的兩個候選基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR分析HaCER3-1基因在脅迫下的表達(dá)量變化，研究成果可望為后續(xù)研究向日葵中烷烴合成機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為油用向日葵(HeliauthusannuusL.)高代自交系‘SKY02R-32’。供試材料種植于10 cm× 10 cm的塑料花盆內(nèi)，在培養(yǎng)箱(GDN型，寧波)內(nèi)培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h，溫度為22℃/21℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質(zhì)提取 對三周齡的向日葵進(jìn)行缺水、200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)、15% 聚乙二醇6000(PEG6000)和H2O(對照組)處理，除缺水處理外各溶液均取100 mL澆灌根系，處理一周后剪取所有葉片提取表皮蠟質(zhì)，每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，利用ImageJ軟件計(jì)算葉面積，用氯仿浸提表皮蠟質(zhì)同時加入20 μg C24烷烴作為內(nèi)參，浸提液過濾至燒杯內(nèi)，揮發(fā)至0.5～1.0 mL時轉(zhuǎn)移到GC瓶內(nèi)，利用氮吹儀吹干，然后加入40 μL吡啶和40 μL BSTFA[N,O-雙(三甲基硅烷基三氟乙酰胺)]混勻并置于70℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束用氮?dú)獯蹈蒅C瓶內(nèi)液體，最后加入800 μL氯仿用于氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS，GCMS-QP2010S，日本島津)分析。

1.2.2 GC-MS分析 利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測浸提的蠟質(zhì)混合物獲得各成分的離子峰，通過檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對各離子峰進(jìn)行定性，利用Lab Solution軟件對各離子峰進(jìn)行積分，獲得峰面積，根據(jù)C24內(nèi)標(biāo)的加入量對所有成分進(jìn)行定量分析。計(jì)算公式如下：

M=(20·S峰)/(S葉·S內(nèi)標(biāo))

(1)

式中，M表示表皮蠟質(zhì)某一成分絕對含量(ng·cm-2)，S峰表示該成分離子峰面積(cm2)，S葉表示該樣品葉片表面積(cm2)，S內(nèi)標(biāo)表示C24烷烴的離子峰面積(cm2)。

1.2.3 烷烴合成候選基因生物信息學(xué)分析 利用擬南芥烷烴合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵數(shù)據(jù)庫(https://www.heliagene.org/)中檢索相應(yīng)同源基因，利用在線工具Pfam(http://pfam.xfam.org)分析蛋白結(jié)構(gòu)域并利用TBtools作圖，運(yùn)用MEGA6軟件的鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 烷烴合成候選基因表達(dá)模式分析 在向日葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/plants/FATAL/cgi/HELAN.cgi)中下載烷烴合成候選基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.2.5HaCER1-1和HaCER3-1的克隆 利用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，以‘SKY02R-32’葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后備用。利用XbaⅠ酶將pCAMBIA2300載體線性化，用無縫克隆試劑盒(DT101-01，DiNing，北京)將目的片段與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，進(jìn)行抗性篩選，挑選單克隆，PCR鑒定后送往上海生工生物股份有限公司測序。測序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒小提試劑盒(StarPrep，GenStar，北京)提取質(zhì)?！皃CAMBIA2300-HaCER1”和“pCAMBIA2300-HaCER3”。

1.2.6 NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達(dá)分析 分別用200 mmol·L-1NaCl(溶劑為H2O)、15% PEG6000和H2O(對照組)100 mL澆灌四葉期向日葵幼苗，處理3、6、12、24 h時剪取葉片，每個處理取3個生物學(xué)重復(fù)，利用RNA提取試劑盒(貝貝生物科技有限公司)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Vazyme，南京)用于qRT-PCR分析，使用QuantStudio3(美國)進(jìn)行qRT-PCR分析，每個反應(yīng)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司的實(shí)時熒光定量試劑盒(A311，康潤誠業(yè)，北京)說明書確定。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質(zhì)分析

為了研究干旱及鹽脅迫對向日葵幼苗表皮蠟質(zhì)的影響，提取了脅迫處理后向日葵的葉表皮蠟質(zhì)進(jìn)行了GC-MS分析。圖1顯示，正常狀態(tài)下三周齡向日葵幼苗葉片表皮蠟質(zhì)主要成分為初級醇、烷烴和脂肪酸等，初級醇含量達(dá)到0.988 μg·cm-2，約占葉片蠟質(zhì)總量的70%～80%，烷烴含量為0.12 μg·cm-2，占10%～14%，脂肪酸含量為0.114 μg·cm-2，占9%～13%。初級醇共鑒定到6種，烷烴鑒定到11種，脂肪酸鑒定到6種。碳鏈長度分析結(jié)果顯示，初級醇的碳鏈長為22-34；烷烴碳鏈長為25-35，C27和C29烷烴含量最高；脂肪酸碳鏈長為16-28。缺水、氯化鈉和PEG的處理均能提高向日葵葉片表皮蠟質(zhì)總量，且缺水和氯化鈉處理下表皮蠟質(zhì)總量升高最為顯著，分別提高了8.8%和8.5%，其中升高的主要是烷烴和脂肪酸的含量，缺水和鹽脅迫處理下，烷烴單位葉面積升高量分別為62.5%和47%，脂肪酸升高量為45%和49%(表2)。

2.2 烷烴合成候選基因生物信息學(xué)分析

利用擬南芥烷烴合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵基因組中進(jìn)行同源比對，共獲的3個AtCER1同源基因和3個AtCER3同源基因，將其命名為HaCER1-1(HanXRQr2_Chr16g0763931)、HaCER1-2(HanXRQr2_Chr15g0714831)、HaCER1-3(HanXRQr2_Chr13g0570411)、HaCER3-1(HanXRQr2_Chr02g0049271)、HaCER3-2(HanXRQr2_Chr06g0262671)和HaCER3-3(HanXRQr2_Chr05g0202951)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)這6個序列與其他物種中的同源序列都含有兩個完整的保守結(jié)構(gòu)域-脂肪酸脫氫酶超家族(FA_hydroxylase)和Wax2_C(圖2)，說明這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕闊N的合成至關(guān)重要。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明3個HaCER1蛋白能夠與其他物種CER1同源蛋白聚為一類；3個HaCER3蛋白同樣與其他CER3同源蛋白聚為一類；HaCER3-1與擬南芥AtCER3的進(jìn)化關(guān)系最近；同時向日葵的這6個蛋白與雙子葉植物親緣關(guān)系更近(圖2)。

表2 不同處理下向日葵葉片表皮蠟質(zhì)各組分的含量Table 2 The content of the cuticular wax compositions in sunflower leaves/(μg·cm-2)

注：柱形圖下方各數(shù)字表示該化合物所含碳原子數(shù)Note：Number below in each column is the carbon atom number of thecorresponding chemical compound圖1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質(zhì)主要組分Fig.1 Main components of sunflower leaf cuticular wax under drought and salt stress

2.3 烷烴合成候選基因表達(dá)模式分析

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得各基因在不同組織中表達(dá)的RPKM值，結(jié)果顯示6個基因在根中的表達(dá)都很低，在莖中只有HaCER3-1和HaCER3-2表達(dá)，在葉片中HaCER1-1和HaCER3-1兩基因的表達(dá)量最高，可能參與了葉片中烷烴的合成。而在向日葵花冠中HaCER1-2、HaCER1-3、HaCER3-2和HaCER3-3均有較高的表達(dá)量(圖3)。

2.4 HaCER1-1和HaCER3-1的克隆

對候選基因HaCER1-1和HaCER3-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，其目的片段與預(yù)期大小一致，約1 700 bp。經(jīng)測序兩個基因的CDS序列分別為1 869 bp和1 674 bp(圖4)，分別包含一個完整開放閱讀框，編碼氨基酸個數(shù)分別為622和557。

2.5 NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，HaCER3-1的表達(dá)受到NaCl和PEG誘導(dǎo)，在12 h內(nèi)隨著處理時間的增加，基因的表達(dá)量均呈逐漸上升的趨勢，在第12 h時表達(dá)量達(dá)到最大值，200 mmol·L-1NaCl溶液的處理可以使HaCER3-1增加10倍以上，15% PEG6000溶液的處理可以使其增加3倍以上；在第24 h時基因的表達(dá)量下降，但仍高于0 h(圖5)。由此推測HaCER3-1在響應(yīng)干旱及鹽脅迫過程中起重要作用。

3 討論與結(jié)論

不同植物的表皮蠟質(zhì)組分及比例均有不同，擬南芥葉片表皮蠟質(zhì)主要由烷烴、醇類和脂肪酸組成，小麥葉片表皮蠟質(zhì)中主要為初級醇、烷烴和二酮，番茄葉片表皮蠟質(zhì)主要由烷烴、初級醇和三萜類組成，糜子的表皮蠟質(zhì)主要是初級醇和烷烴，約占蠟質(zhì)總量的95%[18-21]。本研究通過GC-MS技術(shù)分析了油葵自交系‘SKY02R-32’葉片的表皮蠟質(zhì)組分，發(fā)現(xiàn)向日葵幼苗表皮蠟質(zhì)主要成分為初級醇、烷烴和脂肪酸等。

注：除向日葵外，其他物種蛋白ID如下AtCER1(NP_001184890.1);AtCER1-like1(NP_171721.3);AtCER3(NP_200588.2);BnCER1(XP_013722199.1);ZmGL1(ONM55119.1);OsGL1-1(XP_015651446.1);OsGL1-2(XP_015623214.1);OsGL1-3(XP_015641638.1);OsGL1-4(XP_015627618.1);OsGL1-5(Q7XDI3.1);OsGL1-6(XP_015624738.1);OsGL1-7 (CAE03390.2);CsCER1(XP_004153200.1);CsCER3(XP_004149879.1)圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹和蛋白保守結(jié)構(gòu)域圖Fig.2 The phylogenetic tree and protein conserved domain analysis

圖3 基因組織表達(dá)譜Fig.3 Gene expression profiles in different tissues

圖5 脅迫下HaCER3-1的表達(dá)量變化Fig.5 HaCER3-1 expression at different time under different abiotic stresses

圖4 HaCER1-1和HaCER3-1的序列Fig.4 Sequences of HaCER1-1 and HaCER3-1

在許多植物中干旱脅迫能夠誘導(dǎo)植物單位葉面積表皮蠟質(zhì)含量的提升，包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatobacum)等[5,22-26]。本試驗(yàn)對向日葵干旱及鹽脅迫后的葉片表皮蠟質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫和鹽脅迫均能提高向日葵葉片單位面積蠟質(zhì)總量。雖然較多研究表明植物表皮蠟質(zhì)與其抗旱性密切相關(guān)，但是表皮蠟質(zhì)組分、結(jié)構(gòu)與植物抗旱性的關(guān)系仍然缺乏深入研究[27]。Leide等[28]發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層透水性與角質(zhì)層的厚度無關(guān)，而是與其特定組分如烷烴有關(guān)。Parsons等[29]在辣椒(Capsicumannuum)采后失水率有關(guān)的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，辣椒采后失水率的高低與蠟質(zhì)總量無關(guān)，而與烷烴比例呈負(fù)相關(guān)。Kim等[30]對18個芝麻品種進(jìn)行缺水處理，之后分析了這些品種的葉片表皮蠟質(zhì)變化，結(jié)果顯示這些品種的葉蠟中平均59%為烷烴，干旱脅迫后葉蠟總量增加34%，其中主要是烷烴的增加。本研究發(fā)現(xiàn)干旱和鹽脅迫后向日葵葉片表皮蠟質(zhì)總量有明顯提升，其中烷烴含量的提高最為明顯，推測烷烴對向日葵響應(yīng)干旱、鹽脅迫，提高保水能力具有重要意義。

Eceriferum(CER)家族是脅迫條件下調(diào)控表皮蠟質(zhì)合成的主要基因家族之一，目前CER基因在擬南芥、小麥、玉米、番茄(Lycopersiconesculentum)、黃瓜(Cucumissativus)等植物中都有報道[6,31-34]。CER1和CER3蛋白被認(rèn)為是烷烴合成途徑的關(guān)鍵酶[7,16,35]。二者在表達(dá)模式、結(jié)構(gòu)域方面有許多相似之處，如兩種蛋白的N端都有一個富含組氨酸的結(jié)構(gòu)域-脂肪酸脫氫酶超家族，C端都有一個WAX2結(jié)構(gòu)域[9]，本研究在向日葵數(shù)據(jù)庫內(nèi)共檢索到3個CER1同源蛋白和3個CER3同源蛋白，6個蛋白序列均有完整的保守結(jié)構(gòu)域，并且系統(tǒng)進(jìn)化樹表明6個蛋白與已知的CER1和CER3同源蛋白進(jìn)化關(guān)系較近。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析6個基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在根、莖和葉組織中表達(dá)的有HaCER1-1、HaCER3-1和HaCER3-2，推測這三個基因在向日葵葉片合成烷烴的過程中起作用。本研究克隆了其中兩個烷烴合成候選基因，命名為HaCER1-1和HaCER3-1，其CDS長分別為1 869、1 674 bp。利用qRT-PCR分析了NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)HaCER3-1的表達(dá)有明顯的上調(diào)。因此推測HaCER3-1可能參與向日葵葉片中烷烴合成，在向日葵響應(yīng)干旱和鹽等脅迫，適應(yīng)缺水環(huán)境的過程中具有重要作用。

干旱和鹽脅迫是限制植物生產(chǎn)力的主要因素之一，轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計(jì)育種是培育抗旱耐鹽品種最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，因此發(fā)現(xiàn)和挖掘向日葵抗逆基因至關(guān)重要。本研究分析了向日葵幼苗葉片表皮蠟質(zhì)組成及干旱、鹽脅迫下其表皮蠟質(zhì)的變化，并克隆了兩個烷烴合成候選基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR技術(shù)分析了脅迫下HaCER3-1的表達(dá)量變化，為后續(xù)深入研究向日葵烷烴合成的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。