董 揚

(黑龍江省農業(yè)科學院齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糜子(PanicummiliaceumL.)是C4作物，對營養(yǎng)和水分要求較低，耐鹽堿、干旱和高溫等極端條件[1]，是北方旱作地區(qū)重要的糧食作物[2-3]。我國具有豐富的糜子種質資源，目前為止共有1萬余份種質資源，其中地方品種資源較多[4]，具有廣泛的遺傳變異性和豐富的抗逆基因[5-6]。糜子的生育期短，是東北等冷涼地區(qū)的救災抗逆作物，在北方有較大的生產優(yōu)勢和地區(qū)優(yōu)勢[7]。萌發(fā)期和幼苗期是植物生長發(fā)育過程中最脆弱而又十分重要的時期，春播時期遭遇的低溫冷害不僅能夠使農作物種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育延遲[8]，甚至使大部分種子失去發(fā)芽能力。有研究顯示東北三省每 3～4 a就會遭受一次低溫凍害[9-10]，造成出苗不齊、苗勢弱、出苗時間延長等后果，最終導致大幅度減產[11]。因此，凍害是東北糜子產區(qū)的主要問題之一。

植物的耐冷性是為適應低溫環(huán)境而產生的一種生理反應，同一物種的不同品種之間在耐低溫性能上存在一定差異[12-13]。在農業(yè)生產上，耐冷品種的選育是解決低溫冷害最直接和最有效的手段[14]。種子在萌發(fā)階段對低溫反應最為敏感，低溫破壞了種子細胞的生物活性，從而大幅度減少種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)等[15]。近年來，已有研究者在種質資源耐冷性鑒定篩選上做了大量工作，Janda 等[16]發(fā)現(xiàn)作物生長溫度低于10℃時就容易發(fā)生低溫冷害。Marocco 等[17]研究表明，玉米在溫度低于10℃時生長明顯緩慢，當環(huán)境溫度在6℃～8℃時停止生長。糜子種子萌發(fā)的最適宜溫度為20℃～30℃[18]，最低萌發(fā)溫度為8℃～10℃[19]。劉杰等[20]測定10℃低溫下81份雜交玉米種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢等性狀，并采用主成分分析和聚類分析等統(tǒng)計方法篩選出耐冷種質材料。張鶴等[21]對68個花生品種進行萌發(fā)期耐冷性鑒定試驗，通過低溫處理和萌發(fā)期性狀測定，最終篩選出18份耐冷型材料。袁雨豪等[22]通過鹽脅迫對100份糜子資源進行萌發(fā)試驗，測定萌發(fā)期的發(fā)芽勢、根鮮重和根長等指標，通過綜合值計算篩選出高度耐鹽糜子。

目前糜子抗逆研究主要集中在抗旱、抗倒伏和抗鹽堿等方面[22-24]，對耐冷能力的研究鮮見報道。因此，對糜子進行耐冷種質資源篩選和評價以及培育專用品種，對推進糜子生產和產業(yè)發(fā)展具有重要實踐意義。本研究以240份糜子種質資源為材料，通過萌發(fā)期低溫處理，調查耐冷性相關指標，應用描述統(tǒng)計分析、相關性分析、主成分分析和聚類分析等分析方法，篩選出適宜北方冷涼地區(qū)種植的糜子優(yōu)異耐冷種質資源，為高寒地區(qū)的糜子種植提供種質參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑龍江省農業(yè)科學院齊齊哈爾分院試驗科研基地位于黑龍江省西部干旱半干旱地區(qū)，試驗區(qū)糜子季平均年降水量410 mm，年均溫度3.4℃，活動積溫2 900℃。糜子品種選取以來源廣泛、適宜本地種植、成熟度好、農藝性狀和產量性狀突出為原則，故本試驗材料是從適宜在該科研基地種植的820份糜子品種資源中，根據(jù)2017—2019年測量的株高、落粒性、穗重、千粒重等農藝性狀和產量性狀指標初步篩選出的240份優(yōu)質糜子資源。

240份糜子資源來自21個國家和地區(qū)，其中中國資源209份，國外資源31份。中國資源中包括新疆11份、山西27份、寧夏16份、陜西16份、青海10份、內蒙古33份、遼寧8份、吉林8份、湖北1份、黑龍江31份、山東7份、云南2份、甘肅17份、西藏1份、江蘇3份、河北13份、海南2份、北京3份(表1)。

1.2 試驗設計

將240份糜子資源放置于人工氣候箱內培養(yǎng)，種子在0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，后用蒸餾水沖洗3次，將種子表面水分吸干，并放置在鋪雙層濾紙直徑為8 cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中均等擺放籽粒飽滿、大小顏色一致的30粒種子，分別于25℃(CK)和10℃(前期最適低溫篩選溫度試驗)等兩個溫度條件下進行萌發(fā)試驗，處理10 d后，轉入25℃條件下恢復生長6 d。每個試驗均設置3次重復。低溫脅迫處理期間無光照，生長恢復階段中每天光照12 h(7∶00—19∶00)，光強度和相對濕度分別設置為2 500 lx的70%。每天記錄發(fā)芽過程中的發(fā)芽粒數(shù)，計算發(fā)芽指數(shù)，生長恢復第3天測定發(fā)芽勢，第6天測發(fā)芽率、根長、根鮮重、芽長、芽鮮重，并計算活力指數(shù)和冷害率。

表1 供試糜子材料信息Table 1 Information of tested broomcorn materials

續(xù)表1：

1.3 測定指標與計算方法

糜子種子根長和芽長均采用游標卡尺測定，其中根長(RL)指從種子胚到最長根尖的長度，芽長(SL)指從種子胚到最長葉尖的長度。種子發(fā)芽勢(GE)、發(fā)芽率(GP)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)、發(fā)芽相對冷害率(CDR)和各指標相對值等指標計算方法分別如式(1)～(6)所示：

發(fā)芽勢(%)=恢復第3天發(fā)芽種子個數(shù)/供試種子個數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子個數(shù)/供試種子個數(shù)×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(第T日的發(fā)芽種子個數(shù)/相應的發(fā)芽天數(shù))

(3)

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)(GI)×胚根鮮重(RFW)

(4)

發(fā)芽相對冷害率(%)=(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率×100%

(5)

指標相對值=各指標處理值/對照值

(6)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0軟件進行相關性分析和主成分分析，用R studio軟件進行聚類分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 萌發(fā)期糜子資源對冷脅迫的響應

240份糜子品種在10℃環(huán)境下萌發(fā)期的各項指標相對值整體小于1，平均值均小于1(如圖1所示)，糜子種子相對發(fā)芽勢為0～100%、相對發(fā)芽率為8%～100%、相對發(fā)芽指數(shù)為1.86%～37.49%、相對芽長為8.99%～93.2%、相對根長為20.59%～298%、相對芽鮮重為2.63%～133.43%、相對根鮮重為17.66%～213.1%、相對活力指數(shù)為1.68%～69.27%、相對發(fā)芽冷害率為0～92%。其中，相對根鮮重、相對活力指數(shù)、相對發(fā)芽冷害率的差異性較大，變異系數(shù)分別為43.27%、58.35%、100.03%。表明不同品種資源的耐冷性存在顯著差異，具有豐富的遺傳多樣性，糜子出苗/生長指標對低溫反應敏感，故可在冷脅迫下可以篩選出耐冷的品種資源。

注：GE：發(fā)芽勢；GP：發(fā)芽率；GI：發(fā)芽指數(shù)；SL：芽長；RL：根長；SFW：芽鮮重；RFW：根鮮重；VI：活力指數(shù)；CDR：冷害率。下同Note:GE:Germination energy;GP:Germination percentage;GI:Germination index;SL:Sprout length;RL:Root length;SFW:Shoot fresh weight;RFW:Root fresh weight;VI:Vitality index;CDR:Chilling damage rate.The same below圖1 萌發(fā)期冷脅迫下性狀相對值描述統(tǒng)計分析Fig.1 Analysis of relative value traits of broomcorn millet under chilling stress at germination stage

2.2 萌發(fā)期冷脅迫下糜子性狀相關性分析

從圖2看出(見 31頁)，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)與相對芽鮮重、相對根鮮重、相對活力指和相對冷害率指標均呈現(xiàn)極顯著負相關關系(P<0.01)；相對根長與相對冷害率、相對芽鮮重、相對活力指數(shù)和相對根鮮重均呈現(xiàn)顯著負相關關系(P<0.05)，與相對發(fā)芽率呈顯著正相關關系(P<0.05)，與相對芽長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽勢呈極顯著正相關(P<0.01)；相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對芽長和相對發(fā)芽指數(shù)指標間呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.01)；相對芽鮮重、相對根鮮重、相對活力指數(shù)和相對冷害率等指標間呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.01)。相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽率指標中，每兩個指標之間的相對系數(shù)均大于0.80，相對芽鮮重、相對活力指數(shù)和相對根鮮重指標中，每兩個指標之間的相對系數(shù)均大于0.80，表明上述指標之間受到冷脅迫的程度是相互關聯(lián)的。

注：*：在0.05水平差異顯著；**：在0.01水平差異極顯著。下同。Note:*：significant difference at 0.05 level;**:significant difference at 0.01 level.The same below.圖2 萌發(fā)期冷脅迫下各性狀指標間相關關系分析Fig.2 Correlation analysis of each character index under cold stress during germination

2.3 萌發(fā)期冷脅迫下糜子性狀主成分分析

對240份糜子冷脅迫下9個相對性狀進行主成分分析，選取3個特征值大于1的主成分。第1主成分的特征值為4.73，貢獻率為52.57%；第2主成分的特征值為2.06，貢獻率為22.87%；第3主成分的特征值為1.06，貢獻率為11.78%。3個主成分的累計貢獻率為87.22 %，共涵蓋了9個相對指標87%以上的數(shù)據(jù)信息，如表2所示。9個測量性狀的變化趨勢可以通過前三個主成分進行表征，且相關性可通過因子負荷量反映(表3)。第1主成分與發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)有較強的正相關關系，表明冷脅迫下糜子發(fā)芽性狀可作為鑒定和評價耐冷性的重要指標。第2主成分與芽鮮重和根鮮重有較強的正相關關系，表明冷脅迫與鮮重有較大關系。第3主成分與根長和芽長存在較顯著的正相關關系，表明根長和芽長對其起主要作用。

表2 3個主成分的特征值以及貢獻率Table 2 Eigen values of 3 principal components and their contribution and cumulative contribution

表3 各因子載荷矩陣Table 3 Loading matrix of all components

2.4 萌發(fā)期糜子資源耐冷性綜合分析

為更直觀地評價240份糜子資源的耐冷性，根據(jù)因子得分計算出總F值，并對其進行排序。設相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長、芽鮮重、根鮮重、活力指數(shù)和冷害率的標準化數(shù)值分別為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9，則根據(jù)相對性狀主成分特征向量(表4)可得到3個主成分表達式：

Y1=0.18X1+0.181X2+0.18X3+0.067X4+

0.057X5-0.153X6-0.158X7-

0.158X8-0.181X9

Y2=0.171X1+0.2061X2+0.181X3+0.167X4+

0.029X5+0.327X6+0.319X7+

0.319X8-0.206X9

Y3=-0.042X1-0.185X2-0.071X3+0.536X4+

0.761X5-0.037X6-0.011X7+

0.001X8+0.185X9

表4 各相對性狀主成分特征向量矩陣Table 4 Eigenvectors matrix of all traits of principal components

以主成分的貢獻率為權重系數(shù)構建各供試材料綜合得分：

F=0.5257Y1+0.22868Y2+0.11783Y3

對240份資源綜合得分排序后，將其分為四大類(圖3)：第1類屬于高度耐冷資源，包括‘89號黑黍子’、‘8號景泰疙瘩紅’、‘81號黃糜子’等22份資源，占供試材料的9.17%；第2類屬于耐冷資源，包括‘11號張川麻糜子’、‘12號古浪半個紅’、‘60號巴盟黃黍子’等138份資源，占供試材料的57.5%；第3類屬于冷敏感資源，包括‘121號札達糜’、‘143號赤糜2號’、‘94號老來黑’等64份資源，占供試材料的26.66%；第4類屬于高度冷敏感資源，包括‘130號野糜子’、‘180號PAN 21’、‘209號年豐3’等16份資源，占供試材料的6.67%。詳見表5。

圖3 240份糜子資源耐冷性排序聚類分析Fig.3 The ranking cluster analysis of cold tolerance of 240 broomcorn millet resources

表5 22份高度耐冷糜子品種資源來源、各性狀相對值及耐冷性排序Table 5 The resource source,relative value of each character and ranking of cold tolerance of 22 broomcorn millet resources with high cold tolerance

2.5 萌發(fā)期糜子資源耐冷相關性狀聚類分析

根據(jù)系統(tǒng)聚類中基于歐式距離的Ward聯(lián)接法，對240份糜子資源采用R studio 軟件進行耐冷相關性狀排序聚類分析如圖4所示，供試資源被分為4個組群，第1～4組群分別共計5、19、23、193份資源，分別占供試材料的2.08%、7.92%、9.58%、80.42%。從各性狀分別在4個聚類組群中的相對平均值來看(圖5)，第1組群相對根長與相對根鮮重的平均值明顯高于其他組群，說明第1組群中地下部分具有較明顯的耐冷特性；第2組群的相對芽勢、相對芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對芽長、相對根長、相對冷害率等6個相對性狀的平均值均處于最低水平，因此在第2組群的19份供試資源中，有14份是耐冷性排序中的后14位，說明第2組群中的資源具有極明顯的冷敏感特性，可定為萌發(fā)期高度冷敏感種質資源；第3組群相對芽長與相對芽鮮重的平均值均高于其他組群，說明第3組群地上部分具有一定的耐冷特性；第4組群相對芽勢、相對芽率、相對發(fā)芽指數(shù)與相對冷害率性狀處于較高水平，說明第4組群的發(fā)芽特性具有明顯的耐冷特性。

圖4 240份糜子資源耐冷相對性狀值聚類分析Fig.4 Cluster analysis of cold-tolerant traits of 240 broomcorn millet resources

圖5 各性狀在聚類組群中的相對平均值Fig.5 The relative mean value of each trait in the cluster group

3 討 論

選育耐冷性強的品種是應對低溫冷害的重要途徑，選擇耐冷性評價的適宜低溫是第一步，種質資源難以在過低溫度下發(fā)芽，而在過高溫度下不能對耐冷性進行區(qū)分。李玉環(huán)等[19]研究表明當溫度低于12℃時容易對糜子造成冷害。在本試驗之前的預試驗中已經確定10℃可作為糜子資源耐冷性評價的適宜溫度，并且通過對本試驗結果的描述性統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)各項指標的相對值整體小于1，變異系數(shù)的變化范圍為20.59%～100.03%，說明10℃低溫可以篩選出耐冷的糜子種質資源。對種質資源進行抗性篩選時，選擇適宜的評價性狀能夠減少誤差，從而真實地表現(xiàn)出耐冷性[25]。萌芽期種質資源的抗性鑒定既要測定其發(fā)芽性狀，也要測量發(fā)芽后其芽和根的生長情況[22]，觀察在低溫下種子發(fā)芽后的強弱。因此本試驗選擇發(fā)芽勢等9個性狀作為萌芽期耐冷性鑒定的性狀指標，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)各性狀之間都存在著顯著或極顯著相關性，表明各耐冷性狀間具有很大的迭加和相互關聯(lián)等特性，所以不能根據(jù)單一或少數(shù)幾個指標進行精準評價。主成分分析是根據(jù)耐冷變量的相關性對各性狀的反映進行綜合分析，清除資源材料間的固有差異，使分析結果更為科學準確[26]。本試驗中主成分分析結果表明發(fā)芽性狀主要反映了糜子資源萌芽期的耐冷性，這與袁雨豪等[22]關于糜子耐鹽堿性研究結果一致，并且與各性狀在聚類組群中反映的結果一致。

本研究以240份糜子品種資源為材料，通過聚類分析完成了對糜子耐冷品種資源的分類，類群之間耐冷差異性較明顯，并且相對性狀聚類分析表明高度冷敏感資源的發(fā)芽性狀均表現(xiàn)最差。糜子對非生物脅迫具有很強的耐受性[1],由于篩選出的萌芽期高度耐冷的糜子種質資源沒有受到外界環(huán)境影響，因此需要進一步將篩選出的資源在大田中進行提前播種或在黑龍江高緯度地區(qū)進行播種，可更加全面地篩選出適宜冷寒地區(qū)種植或育種研究的耐冷糜子種質資源，以期保證東北地區(qū)糜子產量的同時可以擴大種植范圍。

4 結 論

本研究綜合采用描述統(tǒng)計分析、相關性分析、主成分分析和聚類分析等分析方法對240份糜子資源9項耐冷性狀進行評價分析，按貢獻率高低可將9個耐冷性狀總結為發(fā)芽性狀因子、芽根鮮重因子及芽根長因子。根據(jù)種質資源耐冷性綜合評價結果進行聚類分析，篩選出‘景泰疙瘩紅’等22個萌發(fā)期高度耐冷品種資源、‘張川麻糜子’等138份耐冷品種資源、‘札達糜’等64份冷敏感品種資源、‘PAN 21’等16份高度冷敏感品種資源。根據(jù)各耐冷相關性狀聚類分析結果，供試資源可被分為4組，即第1組群地下部分具有較明顯的耐冷特性，第2組群具有極明顯的冷敏感特性，第3組群地上部分具有一定的耐冷特性，第4組群的發(fā)芽特性具有明顯的耐冷特性。