潘靜，張俊超，陳有軍，周青平*

（1.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.四川省抗逆牧草種質創(chuàng)新及生態(tài)修復工程實驗室，四川 成都 610041；3.四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站，四川成都 610041）

DNA標記作為近年來迅速發(fā)展的一種技術手段，廣泛地應用于植物分子遺傳學領域［1］。在功能基因組學的研究中，基于目的基因開發(fā)的功能性分子標記是今后分子標記發(fā)展的必然方向［2］。目的起始密碼子多態(tài)性標記（start codon targeted polymorphism，SCoT）是在水稻（Oryza sativa）上開發(fā)的一種類似隨機引物多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）的基因型分子標記，它利用較高的退火溫度（50℃）能夠有效地減少假陽性擴增的可能性［3］。與其他標記相比，SCoT標記結合了內部簡單重復序列標記（inter-simple sequence report，ISSR）和RAPD標記的優(yōu)點，具有更好的穩(wěn)定性、重復性等優(yōu)點，同時有效的產(chǎn)生多態(tài)性，更好地反映物種遺傳多樣性及親緣關系［4-5］。SCoT技術是一種新型分子標記技術，在遺傳多樣性和遺傳育種等研究中具有重要的意義。自2009年被開發(fā)以來，該分子標記已大量應用于經(jīng)濟作物的相關研究中，如楊桃（Averrhoa carambola）［6］、葡萄（Vitis vinifera）［7］、芒果（Mangifera indica）［8］和蓖麻（Ricinus communis）［9］等。但在牧草領域中的相關研究較少，目 前 在 紫 花 苜 蓿（Medicago sativa）［2］、燕麥（Avena sativa）［10］、高 粱（Sorghum bicolor）［11］、老芒麥（Elymus sibiricus）［12］和鴨茅（Dactylis glomerata）［13］等有少量報道。

披堿草屬（Elymus）是小麥族中最大的屬，廣泛分布于美洲、歐洲、亞洲和非洲。受生態(tài)環(huán)境差異的影響，種質間存在較大的形態(tài)差異。作為禾本科小麥族披堿草屬多年生疏叢型植物，披堿草（Elymus dahuricus）、老芒麥和垂穗披堿草（Elymus nutans）是青藏高原高寒地區(qū)廣泛分布的野生種質資源，具有抗寒性強、適應性強和易栽培等優(yōu)良性狀，是高寒地區(qū)優(yōu)質的飼用牧草資源［14-15］。野生老芒麥、披堿草和垂穗披堿草在青藏高原地區(qū)分布廣泛，對野生披堿草屬種質進行收集和鑒定，是挖掘牧草優(yōu)異性狀和種質資源遺傳改良工作的重要基礎。

老芒麥、披堿草和垂穗披堿草均為花序下垂類披堿草屬物種，根據(jù)其形態(tài)學特征可以將這3個物種區(qū)分開來。但因其生長條件的差異，會對基于形態(tài)學特征的物種鑒別產(chǎn)生影響［16］。陳麗麗等［17］利用形態(tài)學觀測和聚類分析等方法對不同地區(qū)的54份披堿草屬種質進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)老芒麥和垂穗披堿草在形態(tài)學上性狀交叉較多。李淑娟［18］對披堿草、垂穗披堿草、肥披堿草（Elymus excelsus）、黑紫披堿草（Elymus atratus）和老芒麥等28份披堿草屬種質進行農(nóng)藝性狀觀測和ISSR分析，結果表明，在收集野外種質資源時，存在著物種混淆的現(xiàn)象。所以，僅通過形態(tài)學性狀對野外披堿草屬種質資源進行鑒別有一定的難度。本研究利用SCoT分子標記對46份野生披堿草屬種質進行遺傳多樣性分析，并構建其DNA指紋圖譜，以期為青藏高原地區(qū)野生披堿草屬種質鑒定、優(yōu)質性狀挖掘、育種實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究的供試材料均來自西南民族大學紅原基地種質資源圃，包含46份披堿草屬種質資源樣品（表1），其中19份為披堿草種質（ED）、13份為垂穗披堿草種質（EN）、14份為老芒麥種質（ES）。2021年6月將供試材料播種于花盆，置于植物生長培育溫室中。采集46份披堿草屬種質的幼嫩葉片樣品，液氮速凍后保存于-80℃冰箱待用。

表1 試驗材料及來源Table 1 Materials used in the study and source

1.2 DNA提取

對每份種質資源采集15株的鮮嫩無病害葉片進行收集、混合并凍干。通過植物基因組DNA試劑盒（北京天根生化）提取DNA。使用NanoDrop-Lite超微量分光光度計（Thermo Science，美國）測定DNA的質量和濃度。最后將合格的樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng·μL-1，保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選

所用80個SCoT引物參 考了Collard等［3］（SCoT 1～SCoT 36）及Luo等［4］（SCoT37～SCoT80）的 報道，引物均由上海生工生物技術有限公司合成，PCR所用2×Es Taq MasterMix混合液（含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs）購自康為世紀生化公司。選取4份植物形態(tài)差異較大的種質材料，預先篩選出22個擴增條帶清晰、重復性較好的SCoT引物，確定它們適宜的退火溫度（表2），用于供試46份披堿草屬野生材料的進一步PCR擴增。

表2 篩選出的引物和退火溫度Table 2 Screened primers and annealing temperatures

1.4 SCoT-PCR擴增

披堿草屬SCoT-PCR擴增體系參照李進等［10］

的方法進行。用于PCR擴增試驗的反應體系為20 μL，包括2 μL模 板DNA（10 ng·μL-1），9 μL 2×Es Taq MasterMix預混液（康為世紀，北京），2 μL引物（10 μmol·μL-1）和7 μL ddH2O。PCR擴 增 反 應 在Eppendorf Master cycler nexus X2 PCR儀 上 進 行，擴增程序為：首先進行95℃預變性5 min；其次是94℃變性1 min；退火（50～62℃）1 min；72℃延伸2 min，反應34個循環(huán)；然后在72℃延伸10 min；最后4℃保存。擴增反應結束后在1倍的Tirs-硼酸-EDTA緩沖液（Tris-Borte-EDTA buffer，TBE）中電泳，擴增產(chǎn)物從含有0.12 ng·mL-1GeneRed（天根生化，北京）的1.3%瓊脂糖凝膠中分離，使用BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)（美國）進行凝膠攝影。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

SCoT為顯性標記，選取條帶清晰且具有重復性的DNA條帶進行統(tǒng)計，將擴增條帶的有或無分別賦值為1和0進行統(tǒng)計，構建0，1矩陣。參考劉新龍等［19］的方法估算出PCR產(chǎn)物的分子量，用于構建46份披堿草屬種質的DNA指 紋 圖譜。使 用Excel 2010和POPGENE 32［20］（V 1.32）計 算 多 態(tài) 性 條帶數(shù) 量（number of polymorphic bands，NPB）、多態(tài)性條帶百分比（percentage of polymorphic bands，PPB）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、觀察等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）。分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）可以將SCoT總變異劃分為群體內和群體間［21］。使用MEGA 7（V 7.0.18）的非加權成對算術平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）來分析不同種質間的關系并構建聚類樹狀圖?；贘accard’s遺傳相似系數(shù)，使用NTSYS（V 2.10）繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。使用Structure（V 2.3.4）軟件分析披堿草屬種質的居群結構，最大似然數(shù)（maximum likelihood estimation，MLE）和△K值來確定最佳分群數(shù)K［22-23］，最終構建46份披堿草屬種質的群體結構圖。族群遺傳變異（population genetic analysis，POPGENE）和AMOVA的輸入文件是在張富民等［24］編寫的DCFA（V 1.1）程序上進行的。同時，參考楊祥燕等［25］的方法構建46份披堿草屬種質的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SCoT引物擴增結果分析

利用篩選出的22條引物對46份披堿草屬材料進行SCoT-PCR擴增，擴增條帶分子量為150～2300 bp。擴增結果表明（表3），22條SCoT引物共獲得清晰且重復性較好的條帶290條，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性條帶比率（PPB）占87.59%，每條SCoT引物擴增條帶變化范圍在9～18條，平均為13.18條，多態(tài)性條帶變化范圍在7～15條，平均為11.55條，每個SCoT引物擴增多態(tài)性比率變幅為66.7%～100.0%，結果表明供試材料間具有較高的多態(tài)性水平，所篩選的SCoT引物具有較高的多態(tài)性檢測效率，可用于對供試的披堿草屬材料進行遺傳多樣性分析。

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 披堿草屬3個物種間的遺傳多樣性 多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）從208（EN）到226（ED），平均值為218。多態(tài)性條帶百分比值（PPB）范圍從89.05%（ES）到92.33%（EN），平均值為90.80%（表4）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）范圍為0.3755至0.4085，平均值為0.3934。Shannon多樣性信息指數(shù)（I）的范圍為0.4488至0.5785，平均值為0.5035。觀察等位基因數(shù)（Na）的范圍為1.9499至1.9888，平均值為1.9663。有效等位基因數(shù)（Ne）的范圍為1.6669至1.7427，平均值為1.7042。披堿草屬3個物種中，垂穗披堿草類群具有較高的遺傳多樣性（NPB=208；PPB=92.33%；Na=1.9888；I=0.5785；H=0.3963；Ne=1.7030）。不同物種類群的遺傳多樣性從高到低排序為：垂穗披堿草＞披堿草＞老芒麥，表明披堿草屬種質資源遺傳多樣性較為豐富。

表4 通過SCoT標記檢測到的披堿草屬3個種群內的遺傳變異Table 4 Genetic variation in three populations of Elymus detected by SCoT markers

2.2.2 披堿草屬3個物種內的遺傳多樣性 AMOVA分析顯示，27.09%的變異在種群間分配，72.91%的變異在種群內分配（表5）。

表5 3個屬的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance（AMOVA）of three genera regions

2.3 居群聚類與結構分析

利用NTSYS-pc軟件對46份披堿草屬材料進行聚類分析。22個引物可將46份種質完全區(qū)分開，結果表明（圖1），46份種質聚為兩大類群（相似性指數(shù)為0.50）。第I類群包括披堿草種質和垂穗披堿草種質；第II類群包括老芒麥種質；第I類群在遺傳相似系數(shù)為0.56處可分為兩個亞類，第i亞類包括19份披堿草種質，第ii亞類包括13份垂穗披堿草種質。根據(jù)SCoT標記所得結果，利用NTSYS-pc軟件進行主成分分析（圖2），不同種質在坐標圖的位置分布可清晰地顯示出它們之間的親緣關系和遺傳差異。位置越近，表明它們之間遺傳差異較小，親緣關系越近；位置越遠則表明它們之間遺傳差異較大，親緣關系較遠。主坐標分析將位置相近的種質劃分到一起，明顯可分為3個類群，19份披堿草種質組成第I類群，13份垂穗披堿草種質組成第II類群，14份老芒麥種質組成第III類群。以上分析表明，聚類分析結果與主成分分析結果基本一致。

圖1 SCoT標記對46份披堿草屬材料親緣關系聚類分析Fig.1 UPGMA dendrogram for 46 resources of Elymus based on SCoT markers

圖2 披堿草屬各種質的SCoT標記三維柱坐標分析散點圖Fig.2 The scatter plot of principal coordinates analysis of Elymus genotypes from SCoT markers

2.4 種群結構分析

利用Structure（V 2.3.4）軟件的Hardy-Weinberg模塊平衡分析46份種質的種群結構。結果表明（圖3）：當K=3時獲得△K最大值，因此確定值為3。并將46份披堿草屬種質劃分為3個種群（圖4），分別記為Q1、Q2、Q3。其中，披堿草的19份種質被分配到了第1組（Q1）；垂穗披堿草的13份種質被分配到了第2組（Q2）；老芒麥的14份種質被分配到了第3組（Q3）。結果表明，種群結構劃分結果與聚類分析結果基本一致。

圖3 基于Structure軟件分析的K值曲線Fig.3 Curve diagram of K value based on Structure analysis

圖4 46份披堿草屬種質群體結構分析Fig.4 Population genetic structure of 46 Elymus genotypes

2.5 基于SCoT標記構建DNA指紋圖譜

通過篩選的22個引物對46份種質的擴增結果分析，結合特異性引物的條帶分辨率及重復性高低，選取其中的SCoT 49、SCoT 54、SCoT 57和SCoT 59共4個引物擴增的16個多態(tài)性位點構建了46份種質的DNA指紋圖譜（圖5）。該指紋圖譜反映了供試的每份種質都有唯一的擴增譜帶，通過該圖譜可準確、快速地將46份種質區(qū)分并準確鑒定出來。

圖5 供試披堿草屬材料指紋圖譜Fig.5 Fingerprinting of 46 Elymus genotypes

3 討論

3.1 披堿草屬種質資源SCoT標記的多態(tài)性分析

DNA分子標記作為有效地檢測出種質資源遺傳多樣性的一種工具，它能有效地結合表型和基因型進行鑒定，從而顯著提高育種效率［26］。目前使用較為廣泛的分子標記有簡單重復序列（simple sequence report，SSR）、ISSR標記、單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism，SNP）、RAPD標記、相關序列擴增多態(tài)性標記（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和SCoT標記等。SCoT分子標記是由基因內的多態(tài)性衍生的標記（gene-targeted markers，GTMs）［27］，與其他類型的DNA分子標記相較，SCoT標記具有設計簡單、操作便捷、成本低廉等特點，并能對目的性狀進行有效的跟蹤，有助于更好地揭示不同種質資源的遺傳背景及種質間的親緣關系［28］。

本研究中，SCoT分子標記分析了46份披堿草屬種質資源，結果表明，22個引物共擴增出290個條帶，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性條帶比率（PPB）值為87.59%，高于前人利用其他分子標記對披堿草屬相關種質進行遺傳多樣性評價的結果。例如，彭語洛等［29］、鄭經(jīng)紅等［30］、苗佳敏等［31］分別利用SSR、ISSR和SRAP分子標記對垂穗披堿草種質進行分析，得到的PPB值分別為79.75%、70.80%和85.86%。前人利用RAPD［32］、ISSR［33］和SRAP［34］標記對老芒麥種質進行分析，得到的PPB值分別為78.65%、77.20%和60.24%。Ma等［35］利用RAPD分子標記93份披堿草屬種質得到的PPB值為78.65%。這些結果都說明SCoT分子標記在披堿草屬種質上具有豐富的多態(tài)性，與其他分子標記相比，SCoT分子標記能夠在披堿草屬種質檢測出較豐富的多態(tài)性位點，為披堿草屬種質的初步鑒定、遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建及基因克隆等研究奠定基礎。此外，隨著第三代分子標記-SNP技術的快速發(fā)展，因其具有豐富的多態(tài)性，遺傳穩(wěn)定性較高、基因組中數(shù)目眾多等優(yōu)點，不僅廣泛應用于重要作物中［例如水稻［36］、玉米（Zea mays）［37］及小 麥（Triticum aestivum）［38］等］，且 老 芒 麥［39］、四 倍 體 雜 交 冰 草（Agropyronspp.）［40］、鴨茅［41］等牧草也利用SNP標記進行了遺傳學分析。隨著基因組學研究的發(fā)展，后續(xù)研究中可進一步基于披堿草屬種質遺傳多樣性的基礎，將SNP分子標記技術與其他生物技術相融合，從而加快傳統(tǒng)牧草育種技術的革新。

3.2 披堿草屬種質資源的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性包含了物種所攜帶的所有遺傳信息，是生物多樣性最重要的指標之一［42］。遺傳多樣性的研究對于物種資源合理利用、遺傳改良、種質創(chuàng)新及雜交育種親本選育均有重要的意義［28］。SCoT分子標記作為一種能對目的性狀進行跟蹤的顯性標記，對其的應用可更好地揭示種質資源的遺傳背景，更直觀地反映出不同種質資源的親緣關系，為種質資源的合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

植物種質遺傳多樣性與基因型［43］、地理環(huán)境［44］、取樣策略［45］均有一定的相關性。早期研究表明，多倍體物種的遺傳模式與二倍體物種相比較為復雜，所以多倍體物種的分子遺傳基礎研究進程較為緩慢［46］。披堿草屬種質遺傳改良過程相對緩慢，這與披堿草屬種質是異源多倍體、繁殖方式和基因隨機變異相關［47-48］。披堿草屬是禾本科小麥組重要的多年生屬，基因型包括異源六倍體和異源四倍體。Zhang等［49］比較了披堿草屬種質的遺傳結構差異性，表明披堿草屬植物種群內具有較高的遺傳變異水平（大于80%）。本研究披堿草屬種質分子遺傳多樣性結果顯示，披堿草屬內不同物種（披堿草、垂穗披堿草和老芒麥）存在高度的遺傳多樣性，多態(tài)性達90.80%，這與國內其他學者的研究結果基本一致［18］。本試驗的分析表明，披堿草屬3個種群內遺傳多樣性（72.91%）大于種群間遺傳多樣性（27.09%），表明披堿草屬種群內的遺傳變異占據(jù)優(yōu)勢。披堿草屬種質因其自身的遺傳特性，同屬不同物種之間遺傳變異較大，從遺傳多樣性的角度看，已具有遺傳分化特性的種質是進行種質遺傳多樣性和種質資源保護的關鍵，同時也是披堿草屬種質資源利用和優(yōu)良性狀改良的依據(jù)，具有重要的利用價值。

有報道認為不同的生態(tài)環(huán)境會導致披堿草屬種質在長期的演化過程中逐步演化出不同的種群、變異種和生活型［50］。本研究的種質資源采集于生態(tài)環(huán)境復雜的青海地區(qū)，錯綜復雜的地貌和多樣化天氣可能促使披堿草屬種質具有更高的遺傳多樣性。因此，為了拓寬遺傳基礎的范圍，從復雜的生態(tài)環(huán)境中收集和鑒定披堿草屬種質是必要的。披堿草、垂穗披堿草和老芒麥作為異源多倍體物種，其基因組背景較為復雜，且各種質的單株間遺傳豐富度較高［51］。取樣策略也是影響種質資源遺傳多樣性的重要因素之一。例如，柴旭田［52］發(fā)現(xiàn)每份箭筈豌豆（Vicia sativa）種質取樣5個單株就可包含各種質80%以上的遺傳變異；車永和等［53］發(fā)現(xiàn)當取樣量在12個單株及以上時能夠反映冰草屬（Agropyron）整體的遺傳變異情況。在后續(xù)的研究中可設置不同的取樣梯度來獲取披堿草屬種質的最適取樣策略，以期深入了解不同種質材料的遺傳多樣性和親緣關系。

3.3 披堿草屬種質資源的遺傳差異性分析

種質資源是牧草遺傳育種的物種基礎，其遺傳多樣性反映了該物種基因的豐富程度，只有了解其種質間的遺傳差異，才能為選擇育種提供理論依據(jù)［54］。本研究的聚類結果顯示，46份披堿草屬種質可分為2大類和4個亞類，兩個種質資源間的遺傳相似系數(shù)在0.50～0.80，該結論與披堿草屬種質遺傳多樣性的RAPD［35］、ISSR［55］、SRAP［56］分析結果大概一致，都表明披堿草屬種質資源間遺傳多樣性較為豐富。因此，在進行披堿草屬新品種選育過程時，應該挖掘和利用披堿草屬優(yōu)異種質，拓寬披堿草屬種質的遺傳基礎，從而為披堿草屬優(yōu)良種質的篩選提供理論依據(jù)。本研究結果表明，在遺傳相似系數(shù)（gentic similarity，GS）為0.50處可將46份披堿草屬種質分為兩大類。披堿草和垂穗披堿草聚為一類，老芒麥單獨聚為一類，因此，從整體上看，本研究聚類結果說明SCoT分子標記可用于披堿草屬的遺傳多樣性分析。同時，聚類結果還顯示，披堿草和垂穗披堿草首先聚類，老芒麥雖然單獨聚為一類，但也表現(xiàn)了很近的遺傳關系。兩個披堿草屬種質（編號：18和44）各自單獨聚為一組，其原因可能是SCoT標記擴增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的標記，也可能是披堿草和老芒麥兩者遺傳背景的復雜性所致。部分披堿草屬種質（編號：18和44）與其他種質資源遺傳差異較大，在今后的工作中，可進一步對其形態(tài)特征、抗逆性及光合生理特性等方面進行深入的探究，以期將其用于與其他種質進行遠緣雜交。在今后開展披堿草屬優(yōu)質牧草選育過程中，應該充分挖掘和利用遺傳背景較寬的優(yōu)良種質，提高披堿草屬種質資源利用率及加快優(yōu)異性狀品種選育的步伐。

3.4 披堿草屬種質資源指紋圖譜構建

DNA指紋圖譜是一種新型的種質鑒別技術，與傳統(tǒng)方法相比，它具有簡單快速、簡便、精確和不受時空條件限制等優(yōu)點，現(xiàn)今在許多種質資源的研究中已經(jīng)相繼構建了DNA指紋圖譜［57］。當前構建植物DNA指紋圖譜的主要方法有引物組合法、單引物法和特征譜帶法［13］。由于披堿草屬野生種質資源遺傳背景較為復雜，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定難以準確區(qū)分不同種質之間的遺傳差異。本試驗利用4個遺傳多態(tài)性較高的SCoT引物組合構建了46份披堿草屬種質的DNA指紋圖譜，每份種質都有其唯一的DNA指紋圖譜。當前我國披堿草屬野生種質的指紋圖譜構建工作尚處于起步階段，為進一步加強披堿草屬的資源利用和創(chuàng)新，亟須盡快建立出披堿草屬種質的DNA指紋圖譜，為披堿草屬種質間的鑒別提供理論基礎。

4 結論

46份披堿草屬種質的遺傳多樣性水平較高，聚類分析與主成分分析結果基本一致，構建的DNA指紋圖譜可準確鑒別46份披堿草屬種質，每份種質均有唯一的DNA指紋圖譜。SCoT分子標記適用于披堿草屬野生種質資源遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構建，可在分子水平上對披堿草屬野生種質資源評價、鑒定和新品種選育奠定基礎。