李昕沛 呂琴琴 劉建峰 劉軍鋒 段海潔 張紅 梁文 王吉利 黨秋萍

(1.西安市第五醫(yī)院，陜西 西安 710082；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003)

祛風(fēng)壯骨顆粒具有補(bǔ)腎、強(qiáng)筋骨、止痛的功效，主要用于骨關(guān)節(jié)炎病、骨質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松癥。祛風(fēng)壯骨顆粒原劑型為糖漿劑，在臨床上應(yīng)用取得了較滿意的療效，獲得了患者的好評(píng)，取得了較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，是我院骨性關(guān)節(jié)炎臨床治療的重要制劑[1-2]。該方由熟地黃、鹿銜草、雞血藤、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉(炙)、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)七味藥組成，其中淫羊藿的特征性成分為淫羊藿苷，現(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿苷具有抗衰老、抗腫瘤、補(bǔ)腎壯陽等功效，能增加心腦血管血流量，促進(jìn)造血功能、增強(qiáng)免疫功能及骨代謝[3]。本研究以淫羊藿苷含量為指標(biāo)，考察祛風(fēng)壯骨顆粒大生產(chǎn)中常用的濃縮和干燥方式對(duì)淫羊藿苷的影響，為大生產(chǎn)中的工藝優(yōu)化提供參考。對(duì)熟地黃、雞血藤、骨碎補(bǔ)、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)進(jìn)行薄層色譜鑒別，并采用HPLC法對(duì)淫羊藿苷進(jìn)行含量測(cè)定，以有效控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；ZKF040型真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)；Waters2695高效液相色譜儀(美國沃特斯，包括自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵，柱溫箱，2489紫外檢測(cè)器)；GB204電子天平(瑞士梅特勒托利多)；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SB-3200D超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；硅膠G薄層板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；硅膠G(青島海浪硅膠干燥劑廠，批號(hào)：111101)；硅膠GF254薄層板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；甲醇、乙腈(Fisher公司，色譜純)。

1.2試藥 淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-200413)；柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110722-200610)；熟地黃對(duì)照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121196-201105)；雞血藤對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1173-200001)；骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1169-200001)；萊菔子對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120928-201007)；祛風(fēng)壯骨顆粒(醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：1105211、1105212、1105213)。

2 濃縮工藝

2.1復(fù)方提取液的制備 按處方比例稱取熟地黃15 g，鹿銜草10 g，雞血藤10 g，骨碎補(bǔ)10 g，肉蓯蓉(炙)10 g，淫羊藿(油炙)10 g，萊菔子(炒)10 g，其中萊菔子用布包和其余六味，加水煎煮三次，第一次加8倍量水，煎煮2.5小時(shí)；第二、第三次加6倍量水，煎煮1.5小時(shí)，合并煎煮液，濾過，得復(fù)方提取液備用。

2.2淫羊藿苷含量測(cè)定方法[1]

2.2.1對(duì)照品溶液配制 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品1.38 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密移取復(fù)方提取液2 mL，加60%乙醇稀釋并定容至10 mL棕色容量瓶中，搖勻，取上清液過濾即得。

2.2.3色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水溶液(30∶70)，等度洗脫7.5 min；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫20 ℃。

2.2.4線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下制備好的對(duì)照品溶液1、3、5、7、9 μL，在“2.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度 (X)與峰面積 (Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得對(duì)照品淫羊藿苷的回歸方程為Y=2×106X+3002.4，r=0.999，在0.138～1.242μg范圍內(nèi)峰面積與對(duì)照品質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1份，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.71%，表明本品12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批處方量藥材6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.8%，表明本方法重復(fù)性好。

2.2.8加樣回收試驗(yàn) 稱取處方量藥材6份，每份加淫羊藿苷適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，再按“2.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，淫羊藿苷的平均回收率為98.5%，RSD為1.06%。

2.3濃縮工藝的考察 將復(fù)方提取液平均分為3份，第一份不做處理，第二份置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60℃(-0.07 MPa～-0.08 MPa)條件下濃縮到60 mL，第三份置于100℃水浴條件下濃縮到60 mL，備用。分別取提取液適量，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，測(cè)定淫羊藿苷的含量，并計(jì)算淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率(見表1)。

表1 濃縮條件考察結(jié)果表

常用的濃縮方法包括常壓濃縮和減壓濃縮，常壓濃縮由于操作時(shí)間較長，容易破壞成分，轉(zhuǎn)移率比減壓濃縮低，因此選用減壓濃縮。

2.4干燥工藝的考察 將上述減壓濃縮的稠膏，分成2份，第一份置于80 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，第二份置于60 ℃真空干燥箱中干燥，備用。取稠膏適量用60%乙醇溶解后，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，測(cè)定淫羊藿苷的含量，并計(jì)算淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率(見表2)。

表2 干燥條件考察結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)表明，在60 ℃、-0.08 MPa～-0.09 MPa條件下干燥較佳。

3 質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.1鑒別

3.1.1熟地黃的薄層鑒別[1,4]取本品5 g，熟地黃對(duì)照藥材0.5 g和熟地黃陰性樣品5 g，加20 mL乙醇超聲提取30 min，濾液蒸干后加2 mL甲醇溶解，分別制成供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干后在紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖1)。

1,2,3-供試品溶液;4-熟地黃對(duì)照藥材溶液;5-熟地黃陰性對(duì)照溶液

3.1.2雞血藤的薄層鑒別[1,5]取本品5 g，雞血藤對(duì)照藥材0.5 g和雞血藤陰性樣品5 g，加水50 mL溶解后用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干后加乙酸乙酯1 mL使溶解，制取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出晾干，放入含濃氨水的展開缸中約3 min后取出，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖2)。

1,2,3-供試品溶液;4-雞血藤對(duì)照藥材溶液;5-雞血藤陰性對(duì)照溶液

3.1.3骨碎補(bǔ)的鑒別[1,6]取本品5 g，骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材0.5 g和骨碎補(bǔ)陰性樣品5 g，加20 mL乙醇，70 ℃水浴溫浸30 min，濾液蒸干，殘?jiān)? ml乙醇溶解，即得供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。另取柚皮苷對(duì)照品0.1 g，加2 mL甲醇溶解，作為對(duì)照品溶液；參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以水飽和正丁醇溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品薄層色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖3)。

1,2,3-供試品溶液;4-骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材溶液;5-柚皮苷;6-骨碎補(bǔ)陰性對(duì)照溶液

3.1.4淫羊藿的鑒別[1,7-8]稱取取本品5 g，淫羊藿陰性樣品5 g，加50 mL水溶解后用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯溶解，制取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品0.1 g，加2 mL甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6.5∶3.5∶1) 10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品薄層色譜相應(yīng)位置顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖4)。

3.1.5萊菔子的鑒別[1,9]取本品5 g，對(duì)照藥材0.5 g和陰性樣品5 g，加20 mL乙醇，70 ℃水浴溫浸30 min，濾液蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，制取供試品溶液，對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6.5∶3.5∶1) 10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出后晾干，置于有濃氨水的展開缸中約3 min后取出，在紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)位置顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖5)。

1,2,3-供試品溶液;4-淫羊藿苷對(duì)照品溶液;5-淫羊藿陰性對(duì)照溶液

1,2,3-供試品溶液;4-萊菔子對(duì)照藥材溶液;5-萊菔子陰性對(duì)照溶液

3.2含量測(cè)定

3.2.1對(duì)照品溶液配制 精密稱取淫羊藿苷1.38 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

3.2.2供試品溶液制備 取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理40 min，放至室溫，再稱重，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過即得。

3.2.3色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱溫20 ℃；流動(dòng)相乙腈-水溶液(30∶70)，等度洗脫7.5 min；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL；對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖如圖6所示。

圖6 對(duì)照品及樣品的高效液相色譜圖

3.2.4線性范圍考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、3、5、7和9 μL，按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿苷回歸方程Y=2×106X+3002.4，r=0.999，在0.138～1.242 μg范圍內(nèi)峰面積與對(duì)照品質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

3.2.5精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液1份，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)得淫羊藿苷RSD為1.3%，表明該儀器精密度良好。

3.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.2%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批祛風(fēng)壯骨顆粒6份，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.8加樣回收試驗(yàn) 稱取同一批祛風(fēng)壯骨顆粒6份約0.50 g，精密稱定，每份加已知量的淫羊藿苷，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果淫羊藿苷的平均回收率為98.1%，RSD為0.86%，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.2.9含量測(cè)定 稱取3批祛風(fēng)壯骨顆粒適量，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算祛風(fēng)壯骨顆粒中淫羊藿苷的含量(mg·g-1)，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

由三批祛風(fēng)壯骨顆粒含量測(cè)定結(jié)果可知，本品每批樣品含淫羊藿苷較為均勻，表明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

4 討論

從表1和表2可見，減壓濃縮、干燥時(shí)淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率高于常壓濃縮、干燥，故采用減壓濃縮、干燥法進(jìn)行復(fù)方的濃縮及干燥有利于防止活性成分的損失。常壓濃縮和常壓干燥下，淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率相對(duì)較低，可能是因?yàn)橐蜣杰赵跍囟容^高的環(huán)境中不穩(wěn)定造成的[10]，因此，為了確?；钚猿煞肿畲笙薅鹊谋槐Ａ簦ㄗh在合適溫度條件下進(jìn)行。

建立了5味中藥材熟地黃、雞血藤、骨碎補(bǔ)、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)的TLC鑒別方法，該法簡便，重現(xiàn)性好。采用HPLC法測(cè)定了祛風(fēng)壯骨顆粒中淫羊藿苷的含量，該法準(zhǔn)確靈敏、快速簡便。本實(shí)驗(yàn)建立的薄層鑒別和含量測(cè)定方法可用于祛風(fēng)壯骨顆粒的質(zhì)量控制[11-14]。