陳卓，胡芯，唐洪玉

西南大學水產(chǎn)學院，重慶 400000

水體中的鉛鋅常為相伴重金屬，其主要來源為鉛鋅礦開采、冶煉、電池加工等工業(yè)活動。鉛作為“重金屬五毒”之一，其在植物體內(nèi)聚集過量會抑制植物的生長以及影響植物的生理代謝過程，嚴重時還可導致植物的死亡[1]。過量的鉛進入人體會影響人體的神經(jīng)、消化和造血系統(tǒng)，如果進入孕婦體內(nèi)還會影響胎兒的智力。而鋅作為鉛的伴生金屬，其本身是生物體的必需元素之一，但當其含量超過機體所需的微量需求時，同樣會對機體造成一定程度的傷害[2]。黑藻（Hydrillaverticillat）又常被稱為輪葉黑藻，分類上屬于水鱉科（Hydrocharitaceae），黑藻屬（HydrillaRich），是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的敏感性植物。其對重金屬的吸附作用一直受到研究者的關(guān)注[3-10]，可作為重金屬污染環(huán)境修復植物和水體污染的指示植物[11-12]。

代謝組學（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的一門新興學科，其概念是由Nicholson于1999年提出，指通過對細胞、組織或生物體內(nèi)所有低分子量代謝物的定性和定量分析研究，闡明各代謝物變化規(guī)律，探討各種刺激因素對機體產(chǎn)生的影響，從小分子代謝物視角揭示生命活動的本質(zhì)和過程[13-14]，通過研究它們能更靈敏更準確地獲知機體狀態(tài)及動態(tài)變化過程[15-16]。代謝組學、基因組學、轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學均屬于系統(tǒng)生物學組成部分，其研究思想類似，且彼此之間有著密切聯(lián)系，但同時又有著明顯的區(qū)別[17]。在外界環(huán)境刺激下，生物體內(nèi)會發(fā)生一系列代謝，但不是每次刺激都會對其基因和蛋白造成顯著影響，而研究機體代謝產(chǎn)物的代謝組學能真正反映出機體已經(jīng)發(fā)生的事件[18]。因此借助代謝組學的技術(shù)來評價環(huán)境污染物暴露帶來的毒性效應優(yōu)勢明顯，特別是在低劑量或環(huán)境劑量污染物的毒性效應評價方面[19]。目前關(guān)于藻類在重金屬脅迫等方面的研究主要是在高濃度、單一脅迫下的吸附效果及生理生化指標研究，對多種重金屬脅迫下黑藻的生理響應研究較少，尤其是鉛鋅脅迫下初生代謝產(chǎn)物研究更是未見報道。本試驗通過對鉛、鋅單一脅迫與鉛鋅復合脅迫下黑藻的初級代謝產(chǎn)物研究，從多個層面分析其在不同脅迫情況下的代謝差異，探究黑藻在面對鉛鋅脅迫后的響應及作用機制，填補相關(guān)研究的空白并以期為鉛鋅脅迫對黑藻代謝物影響的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為鉛鋅污染檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試驗材料及處理

試驗材料取自西南大學水產(chǎn)學院實驗教學中心實習實訓基地。將采集到的黑藻清洗干凈后移入室內(nèi)水池，用改良后的10% Hoagland營養(yǎng)液[20]進行培養(yǎng)馴化，溫度為（25±0.4） ℃，pH 6.5±0.2，光照周期為12 h∶12 h（L∶D），每2天更換一次培養(yǎng)液，每天用HNO3或NaOH調(diào)節(jié)pH值。培養(yǎng)1個月后，選取新長莖葉且長勢一致的黑藻進行正式試驗。

1.2 黑藻培養(yǎng)及試驗條件

正式試驗容器為透明整理箱（400 mm×300 mm×200 mm），底部采用固植板將黑藻固定住，試驗條件管理同馴化期一致。培養(yǎng)一周后進行鉛、鋅（分別以Pb（NO3）2和ZnSO4·7H2O形式加入水體中）脅迫，試驗采用二因素設(shè)計，鉛、鋅各濃度設(shè)置參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 3838—2002）中的Ⅴ類和超Ⅴ類標準濃度值，具體處理設(shè)置如表1所示，共7個處理，每個處理3個平行。在處理28 d后采集對照組S1（CK）和處理組S4（Pb0.10）、S5（Pb0.20）、S16（Zn2.00）、S21（Zn4.00）、S19（Pb0.10+Zn2.00）、S25（Pb0.20+Zn4.00）的黑藻莖葉，液氮處理后放置于-80 ℃冰箱保存。其中每個處理組3個生物學重復。

1.3 代謝物提取

（1）選取生長狀況相似的黑藻莖葉，液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存；（2）將保存樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥；（3）冷凍干燥后的樣品利用研磨儀在30 Hz下研磨1.5 min至粉末狀；（4）研磨后稱取100 mg粉末狀樣品，置于0.6 mL 70%甲醇提取液中溶解；（5）將溶解后的樣品置于4 ℃冰箱過夜提取，期間渦旋6次，以提高提取率；（6）處理后的樣品在10 000g下離心10 min，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，并采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測分析。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相：A相為超純水（加入0.04%的乙酸），B相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，10.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，11.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱溫40℃；進樣量4 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）溫度設(shè)置為550 ℃，質(zhì)譜電壓設(shè)置為5 500 V，簾氣（CUR）206 850 Pa，碰撞誘導電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行掃描檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用UPLC-MS/MS檢測技術(shù)，利用構(gòu)建的植物初生代謝物數(shù)據(jù)庫，智能二級譜匹配方法對物質(zhì)定性，采用三重四級桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測物質(zhì)相對含量，隨后利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過三重四級桿篩選出每個物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度（CPS），用MultiaQuant軟件進行色譜峰的積分和校正工作。本試驗采用單變量、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）多元統(tǒng)計分析方法，對代謝物進行定性定量分析。

單變量統(tǒng)計分析方法包括參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗。多元統(tǒng)計方法PCA用R軟件（www.r-project.org/）內(nèi)置統(tǒng)計prcomp函數(shù)，設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True，對數(shù)據(jù)進行歸一化。OPLS-DA在原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后，再進行中心化處理，利用R軟件中的Metabo AnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)對數(shù)據(jù)進行分析。評價OPLS-DA模型時，Q2表示模型的預測能力，Q2>0.5時可認為是有效的模型，Q2>0.9時為出色的模型。

表1 試驗處理組設(shè)置Table 1 The settings of treatment group

本研究差異代謝物篩選標準。（1）選取差異倍數(shù)值fold change≥2和fold change≤0.5代謝物，即代謝物在對照組和實驗組中差異為2倍以上（顯著上調(diào)）或0.5倍以下（顯著下調(diào)）認為差異顯著。（2）在上述的基礎(chǔ)上，選取VIP≥1的代謝物。VIP值表示對應代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，一般認為VIP≥1的代謝物為差異顯著。

2 結(jié)果分析（Results）

2.1 黑藻初生代謝物定性分析結(jié)果

本研究基于UPLC-MS/MS檢測平臺和相應的數(shù)據(jù)庫共檢測出342個代謝物，其中有機酸126種，脂類80種，氨基酸及其衍生物71種，核苷酸及其衍生物39種，糖和醇類20種，維生素6種。

2.2 單一鉛、鋅脅迫黑藻代謝物差異分析

通過對照組（S1）與Pb0.10單一處理組（S4）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為40.84%，第二主成分（PC2）值為19.86%（圖1（a））；通過對照組（S1）與Pb0.20單一處理組（S5）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為36.97%，第二主成分（PC2）值為25.01%（圖2（a）），且各圖中的2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明對照組和單一鉛處理組之間存在明顯差異。對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實驗驗證，模型的有效性驗證圖如圖1（b）、圖2（b）所示，Q2分別為0.808、0.846，表明所建模型可靠。橫線對應原始模型的R2Y和Q2，紅點和藍點分別代表Y置換后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相應點都不超過相應的線，說明該模型有意義。

根據(jù)代謝物差異篩選標準（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與對照組相比，Pb0.10單一處理組有32個顯著差異代謝物，Pb0.20單一處理組有19個顯著差異代謝物。在這些差異代謝物中，共有11個相同的差異代謝物，其中，5個代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），分別為N-苯乙?；?L-谷氨酰胺、芥子酸吡喃葡萄糖酯、香草酸葡萄糖苷、異水楊酸-O-葡萄糖、海藻糖-6-磷酸等酚酸類和糖類物質(zhì)；6個代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），分別為酪胺、對香豆酰咖啡酰酒石酸、沒食子鞣質(zhì)、溶血磷脂酰乙醇胺18:0（2n異構(gòu)）、十七烷酸和順-10-十七碳烯酸等脂類物質(zhì)。

通過對照組（S1）與Zn2.00單一處理組（S16）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為60.48%，第二主成分（PC2）值為14.56%（圖3（a））；通過對照組（S1）與Zn4.00單一處理組（S21）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為55.64%，第二主成分（PC2）值為18.81%（圖4（a）），且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明對照組和單一鋅處理組之間存在明顯差異。對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實驗驗證（模型的有效性驗證圖如圖3（b）、圖4（b）所示），Q2分別為0.979、0.974，表明所建模型極好，且該模型有意義。

圖2 對照組（S1）與Pb0.20單一處理組（S5）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 2 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Pb0.20 single treatment group （S5）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖3 對照組（S1）與Zn2.00單一處理組（S16）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 3 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn2.00 single treatment group （S16）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根據(jù)代謝物差異篩選標準（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與對照組相比，Zn2.00單一處理組有108個顯著差異代謝物，Zn4.00單一處理組有85個顯著差異代謝物。在這108個和85個差異代謝物中，共有65個相同的差異代謝物，其中有46個代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括1-甲基組氨酸、5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、谷胱甘肽、黃嘌呤、D-葡萄糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸、γ-氨基丁酸、奎尼酸和檸檬酸等氨基酸、核苷酸、糖和有機酸物質(zhì)；有19個代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括1’-O香草酰-β-D-葡糖苷、5’-葡糖基氧代茉莉酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯、巖白菜素、花生四烯酸和棕櫚油酸等酚酸類和脂類物質(zhì)。

2.3 單一鉛、鋅處理組與鉛、鋅復合處理組之間黑藻代謝物差異比較

通過Pb0.10單一處理組（S4）與Pb0.10+Zn2.00復合處理組（S19）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為45.73%，第二主成分（PC2）值為28.57%（圖5（a））；通過Pb0.20單一處理組（S5）與Pb0.20+Zn4.00復合處理組（S25）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為55.82%，第二主成分（PC2）值為17.68%（圖6（a）），且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明單一鉛處理組和對應濃度的鉛、鋅復合處理組之間存在明顯差異。對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實驗驗證（模型的有效性驗證圖如圖5（b）、圖6（b）所示），Q2分別為0.925、0.953，表明所建模型極好。橫線對應原始模型的R2Y和Q2，紅點和藍點分別代表Y置換后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相應點都不超過相應的線，說明該模型有意義。

圖4 對照組（S1）與Zn4.00單一處理組（S21）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 4 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn4.00 single treatment group （S21）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖5 Pb0.10單一處理組（S4）與Pb0.10+Zn2.00復合處理組（S19）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 5 Difference analysis of metabolites between Pb0.10 single treatment group （S4） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根據(jù)代謝物差異篩選標準（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與Pb0.10單一處理組相比，Pb0.10+Zn2.00復合處理組有75個顯著差異代謝物；而相比Pb0.20單一處理組，Pb0.20+Zn4.00復合處理組有87個顯著差異代謝物。在這75個和87個差異代謝物中，共有45個相同的差異代謝物，其中有31個代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括5-氨基戊酸、5-氧化脯氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸、奎尼酸、檸檬酸和溶血磷脂酰甘油（16:0）等氨基酸、糖類、有機酸和脂質(zhì)；有14個代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括巖白菜素、煙酰胺和棕櫚油酸等酚酸類、維生素和脂質(zhì)。

圖6 Pb0.20單一處理組（S5）與Pb0.20+Zn4.00復合處理組（S25）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 6 Difference analysis of metabolites between Pb0.20 single treatment group （S5） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25） Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

2.4 鋅單一處理組與鉛、鋅復合處理組之間黑藻代謝物差異比較

通過Zn2.00單一處理組（S16）與Pb0.10+Zn2.00復合處理組（S19）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為45.54%，第二主成分（PC2）值為20.13%（圖7（a））；通過Zn4.00單一處理組（S21）與Pb0.20+Zn4.00復合處理組（S25）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為38.46%，第二主成分（PC2）值為21.20%（圖8（a））。且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明Zn2.00單一鋅處理組和對應濃度的鉛、鋅復合處理組之間存在明顯差異。對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實驗驗證（模型的有效性驗證圖如圖7（b）、圖8（b）所示），Q2分別為0.603、0.755，表明所建模型可靠，且該模型有意義。

根據(jù)代謝物差異篩選標準（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與Zn2.00單一處理組相比，Pb0.10+Zn2.00復合處理組有29個顯著差異代謝物，其中有25個代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括對羥基苯甲酸、次黃嘌呤、鳥苷、葵二酸和石榴酸等酚酸類、核苷酸、有機酸和脂質(zhì)；有4個代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），分別為L-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（順-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）。與Zn4.00單一處理組相比，Pb0.20+Zn4.00復合處理組有17個顯著差異代謝物，其中只有2個代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），分別為酚酸類的去鼠李糖異洋丁香酚苷B和對苯二甲酸；而有15個代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括谷胱甘肽還原型、順式-4-羥基-D-脯氨酸、2-脫氧腺苷、5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、煙酰胺和延胡索酸（富馬酸、反丁烯二酸）等氨基酸和核苷酸類物質(zhì)。

試驗結(jié)果表明黑藻在單一Pb2+脅迫后會使酚類、糖類物質(zhì)含量增加，脂類物質(zhì)含量減少。在引入Zn2+復合脅迫后進一步促進了黑藻的糖類物質(zhì)含量增加，可見鉛鋅復合在促進黑藻糖類物質(zhì)增加方面存在協(xié)同作用。其原因可能是植物體在受到重金屬脅迫后，體內(nèi)產(chǎn)生一系列抗逆性反應，這些反應的維持均需要糖類化合物提供大量能量。另外，在維持機體滲透壓穩(wěn)定方面也需要可溶性糖類起作用。

圖7 Zn2.00單一處理組（S16）與Pb0.10+Zn2.00復合處理組（S19）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 7 Difference analysis of metabolites between Zn2.00 single treatment group （S16） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖8 Zn4.00單一處理組（S21）與Pb0.20+Zn4.00復合處理組（S25）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗證圖。Fig. 8 Difference analysis of metabolites between Zn4.00 single treatment group （S21） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

而黑藻在單一Zn2+脅迫后會導致氨基酸、核苷酸、糖和有機酸等物質(zhì)含量增加，酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少。在高濃度脅迫下（Pb0.10+Zn2.00），鉛鋅復合可進一步促進Zn2+使黑藻的核苷酸、有機酸物質(zhì)含量增加，抑制Zn2+使黑藻的酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少的作用，可見鉛鋅復合在促進黑藻核苷酸、有機酸物質(zhì)增加等方面存在協(xié)同作用，在使黑藻的酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少方面存在拮抗作用；在超高濃度脅迫下（Pb0.20+Zn4.00），鉛鋅復合會抑制Zn2+使黑藻的氨基酸和核苷酸物質(zhì)含量增加、酚酸類物質(zhì)含量減少的作用，可見超高濃度的鉛鋅復合在使黑藻的氨基酸和核苷酸物質(zhì)含量增加、酚酸類物質(zhì)含量減少方面存在拮抗作用。不同濃度下產(chǎn)生不同結(jié)果的主要原因是植物體對于重金屬脅迫的響應并不是一直持續(xù)升高的，當某種重金屬濃度逐漸升高并超過某個特定閾值后，機體代謝程度往往是逐漸升高后降低并最終保持穩(wěn)定的。

3 討論（Discussion）

目前，有關(guān)代謝組學在環(huán)境領(lǐng)域中的應用所涉及的物種主要包括微生物、植物和動物等。在環(huán)境科學領(lǐng)域中，代謝組學主要研究生物機體在受到外界環(huán)境因素刺激后的代謝變化情況。與基因組學和蛋白質(zhì)組學不同的是，代謝組學可以捕捉生物機體生理代謝的瞬間變化，其靈敏的變化可以用來指示或評價該環(huán)境因素對生物機體或組織器官的毒理效應[21-23]，尤其是某些代謝物的上下調(diào)可能標記著該代謝通路上的某信號缺陷或被激活[19]。由此可見，代謝組學在環(huán)境領(lǐng)域中的應用是可行的。

生物機體中游離的氨基酸及其衍生物，不僅能合成機體生命活動所需的各種蛋白質(zhì)，還能幫助維持各種膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是細胞滲透調(diào)節(jié)的重要有機溶劑，具有保護膜系統(tǒng)、減少體內(nèi)蛋白質(zhì)降解和維持機體各類酶結(jié)構(gòu)正常等作用，能直接或間接對機體受到的脅迫做出響應，因此氨基酸在研究機體生理機制中占有重要作用。Ruiz等[24]的研究表明缺硼狀態(tài)下可抑制機體蛋白質(zhì)合成，并降低硝酸還原酶活性以及硝酸鹽的同化能力，從而降低植物固氮能力。酚酸類物質(zhì)是一類含有酚環(huán)的有機酸，其具有殺菌的功效，廣泛存在于植物體內(nèi)，參與機體的各種代謝。核苷酸及其衍生物是一類由嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸3種物質(zhì)組成的化合物，其主要參與機體核酸的構(gòu)成，同時還具有參與機體三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等能量代謝相關(guān)的生物學功能。糖是植物進行光合作用后的產(chǎn)物，同時也是機體進行呼吸作用時的底物，并能為機體生長發(fā)育提供能量，因此其在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，且有研究表明植物在應激條件下所累積的可溶性糖可作滲透壓調(diào)節(jié)劑，對機體的細胞膜和蛋白質(zhì)起到保護作用[25]。維生素是維持機體健康的一類有機化合物，其不是構(gòu)成機體的基礎(chǔ)物質(zhì)，也不是能量的來源，但是卻能參與機體的代謝調(diào)節(jié)，在生物機體生長發(fā)育與抗性中起到重要作用。有機酸作為重要的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，個別物質(zhì)具有抗氧化功能，在抗性生理過程中同樣起到至關(guān)重要的作用。Liu等[26]通過研究發(fā)現(xiàn)有機酸對鎘有一定活化作用，且超富集生態(tài)型東南景天可通過調(diào)節(jié)其根系內(nèi)有機酸的合成來適應鎘的脅迫。脂質(zhì)是機體中生物膜的重要組成部分，個別脂類含量的減少會直接破壞機體細胞膜結(jié)構(gòu)，從而引發(fā)一系列生理問題。

基于本試驗的初生代謝組學分析可知，與對照組相比，在0.10 mg·L-1和0.20 mg·L-1Pb2+單一脅迫中，共有11種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，出現(xiàn)顯著上調(diào)的主要為酚酸類和糖類物質(zhì)，出現(xiàn)顯著下調(diào)的主要為脂類物質(zhì)，其中涉及到苯丙氨酸代謝、糖類代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等生理過程，說明鉛脅迫下，黑藻酚酸類物質(zhì)和糖類物質(zhì)起到了主要的抗性作用，同時黑藻在鉛脅迫下，其機體的脂類物質(zhì)減少，導致細胞膜可能受到了一定的損害。糖類的合成和分解會影響細胞的滲透性，而滲透能力的變化可以影響機體的抗逆能力，因此細胞內(nèi)糖類的累積對細胞具有一定保護作用，可以增強植物的抗逆能力[27]。羅慶[28]在研究不同鉛濃度下東南景天內(nèi)糖類代謝物的變化中發(fā)現(xiàn)，隨著鉛濃度的升高，東南景天根系分泌物中的半乳糖、葡萄糖和麥芽糖等糖類代謝物就表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢。趙麗娟[17]的研究同樣證實了這一點，在低濃度鎘脅迫下，菠菜和玉米幼苗內(nèi)與能量代謝相關(guān)的葡萄糖、蔗糖和半乳糖等糖類化合物含量顯著上調(diào)。在鉛（1 000 mg·L-1）脅迫下，蘿卜根內(nèi)果糖、葡萄糖和半乳糖含量升高，但鎘脅迫下（400 mg·L-1）3種糖類代謝物的含量卻呈現(xiàn)出降低的趨勢。其原因推測可能是由于在面對不同濃度重金屬脅迫下的反應機制存在些微差距，即在低濃度下植物體分泌糖類等物質(zhì)用于富集吸收金屬離子，當金屬離子濃度高于機體耐受閾值便停止吸收以防止對機體產(chǎn)生損害[17,28]。在2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1Zn2+單一脅迫中，共有65種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，其中氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、糖及醇類和有機酸含量均顯著上調(diào)，而酚酸類和脂質(zhì)含量均有部分上調(diào)，部分下調(diào)，涉及到檸檬酸鹽循環(huán)（TCA循環(huán)）、精氨酸和脯氨酸代謝、糖代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（其他抗生素）、碳代謝和ABC轉(zhuǎn)運子代謝等生理過程，說明單一鋅脅迫下，促進了黑藻機體氨基酸、核苷酸和糖類等物質(zhì)的合成，機體為抗擊逆境進行了許多代謝調(diào)節(jié)。有研究表明，脯氨酸等氨基酸類物質(zhì)會和金屬離子螯合，形成穩(wěn)定的螯合物從而達到解毒的作用[29]。此外Zn2+單一脅迫中谷胱甘肽與對照組（CK）相比出現(xiàn)顯著上調(diào)，這與本研究所測定到的谷胱甘肽（GSH）含量變化一致，因此進一步驗證了鋅脅迫對黑藻GSH的影響。王珊珊[30]在柵藻對重金屬離子的富集及其機理的研究中也發(fā)現(xiàn)GSH、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與金屬離子濃度呈正相關(guān)，與本實驗結(jié)果相一致。由此可見，黑藻在重金屬耐受過程中會合成谷胱甘肽及其相關(guān)抗氧化酶等物質(zhì)以保護細胞免受傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)，N苯乙?；?L-谷氨酰胺、酪胺、對香豆?？Х弱＞剖?、沒食子鞣質(zhì)和異水楊酸-O-葡萄糖只在單一鉛脅迫組中發(fā)生了顯著變化，因此這幾種代謝物或許可以作為鉛脅迫的代謝標志物，而5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸和L-焦谷氨酸等多個代謝物只在單一鋅脅迫組中發(fā)生了顯著變化，因此這些代謝物或許可以作為鋅脅迫的代謝標志物。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)芥子酸吡喃葡萄糖酯和香草酸葡萄糖苷這2種代謝物在單一鉛脅迫中表現(xiàn)為顯著上調(diào)，而在單一鋅脅迫中表現(xiàn)為顯著下調(diào)，說明這2種代謝物的含量或許可以作為區(qū)分鉛、鋅脅迫的指示代謝物。

在復合脅迫中，Pb0.10+Zn2.00和Pb0.20+Zn4.00處理組與相應的單一鉛處理組相比，共有45種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，出現(xiàn)顯著上調(diào)的主要為氨基酸、糖類、有機酸和脂質(zhì)，出現(xiàn)顯著下調(diào)的主要為酚酸類、維生素和脂質(zhì)，其中涉及到檸檬酸鹽循環(huán)（TCA循環(huán)）、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和碳代謝等生理過程，說明相比單一鉛脅迫，鉛鋅復合脅迫后黑藻機體內(nèi)的機體受到的刺激增大，體內(nèi)產(chǎn)生大量的氨基酸、糖類等物質(zhì)來對抗不良環(huán)境。高慧兵[31]在研究中也提到，在鉛鋅復合脅迫時，蓖麻葉片中脯氨酸含量隨脅迫濃度的增加而增加，可能是高濃度脅迫時鋅、鉛發(fā)生協(xié)同作用，毒性增強，導致作為清氧劑的脯氨酸積累量增加，以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，緩解高濃度重金屬的迫害。郭曉音等[32]的研究也證實了這一點，在高濃度鋅（或鎘）的加入與土壤中的鎘（或鋅）發(fā)生協(xié)同作用，導致秋茄中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、有機酸的積累量增加，以緩解高濃度重金屬的脅迫；另外，在復合脅迫下有多種脂質(zhì)代謝物顯著上調(diào)，其原因可能是鉛鋅脅迫后，對黑藻細胞膜的傷害增大，此時機體通過不斷地合成脂質(zhì)來修補重金屬對細胞的傷害；鉛鋅復合可進一步促進Pb2+使黑藻的糖類物質(zhì)含量增加的作用，說明黑藻體內(nèi)的糖類物質(zhì)很有可能與超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）合成以及其他抗氧化酶或物質(zhì)成正相關(guān)。Pb0.10+Zn2.00處理組與Zn2.00單一脅迫相比有29個代謝差異物，其中有25種代謝物含量顯著上調(diào)，主要為酚酸類、核苷酸、有機酸和脂質(zhì)，有L-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（順-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）4個代謝物出現(xiàn)下調(diào)。Pb0.20+Zn4.00處理組與Zn4.00單一脅迫相比有17個代謝差異物，其中15種代謝物含量顯著下降，主要為氨基酸類和核苷酸類；2種代謝物含量上升，均為酚酸類，說明超高濃度Pb2+、Zn2+復合脅迫與單一Zn2+脅迫相比抑制了黑藻氨基酸、核苷酸的合成，導致黑藻機體抗性能力的下降，說明黑藻中氨基酸和核苷酸是機體抗氧化代謝途徑中重要的組成部分。從本研究結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，2組鉛鋅復合脅迫處理與相應的單一鉛處理組之間有共同的差異代謝物，而與相應的單一鋅處理組之間沒有共同的差異代謝物，因此初生代謝物一定程度上可以協(xié)助統(tǒng)一探討鉛鋅復合脅迫與單一鉛脅迫之間生理代謝的區(qū)別，但在探討鉛鋅復合脅迫與單一鋅脅迫之間生理代謝區(qū)別時可能需要根據(jù)不同情況具體去分析。

綜上所述，鉛單一脅迫主要可促進黑藻機體酚酸類和糖類物質(zhì)的生成，抑制脂類的生成。鋅單一脅迫對機體代謝物的影響較多，其中可主要促進氨基酸、核苷酸、糖類和有機酸等代謝物的生成，抑制部分酚酸類和脂質(zhì)代謝物的生成。相比單一鉛脅迫，鉛鋅復合脅迫可主要促進黑藻氨基酸、糖類、有機酸和脂質(zhì)等代謝物的合成，抑制酚酸類、維生素和脂質(zhì)等代謝物的合成。相比單一鋅脅迫，高濃度鉛鋅復合脅迫（Pb0.10+Zn2.00）可主要促進酚酸類、核苷酸、有機酸和脂質(zhì)等代謝物的合成，抑制以谷胱甘肽為代表的氨基酸等代謝物的合成；超高濃度鉛鋅復合脅迫（Pb0.20+Zn4.00）可主要促進對苯二甲酸和去鼠李糖異洋丁香酚苷B 2種酚酸類代謝物的合成，抑制氨基酸、核苷酸、維生素和有機酸等代謝物的合成。