桑靈麗，王揚眉，李宏慧，肖靜

南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境毒理學(xué)教研室，南通 226019

二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide, DMF）因其理化性質(zhì)優(yōu)良而在工業(yè)生產(chǎn)和生活消費領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，使用或生產(chǎn)過程中DMF可向土壤、水體和大氣等環(huán)境介質(zhì)擴(kuò)散蓄積，并通過呼吸、皮膚或消化等途徑進(jìn)入機(jī)體[1]。代謝動力學(xué)實驗表明DMF主要經(jīng)肝細(xì)胞色素P450家族成員2E1代謝生成異氰酸甲酯等活性代謝產(chǎn)物，從而引起肝臟、腎臟和心臟等多系統(tǒng)毒性，其中尤以肝臟損害最為顯著[2-4]。體內(nèi)外實驗均證實DMF可引起肝細(xì)胞凋亡、肝酶異常，還可增加機(jī)體對其他外源化合物的敏感性[5-7]。對此有研究歸結(jié)于活性氧（ROS）有關(guān)的氧化應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)，但同時也有研究通過基因敲除小鼠和人群丙二醛水平分析等結(jié)果推測，在DMF暴露中存在與氧化應(yīng)激無關(guān)的損傷方式[7-9]，但迄今為止DMF肝損害效應(yīng)的具體途徑和相關(guān)分子尚不明確。

Toll樣受體4（toll-like receptors 4, TLR4）作為一種先天免疫因子，已被證明在汞、砷和環(huán)境有機(jī)污染物等多種外源化學(xué)物所致肝損傷中發(fā)揮作用，可在內(nèi)、外源信號誘導(dǎo)下，通過宿主繼發(fā)危險相關(guān)分子模式激活下游靶標(biāo)如核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）、蛋白激酶B（protein kinase B, Akt），誘發(fā)與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor, TNF-α）、白介素1和白介素6等相關(guān)的炎性反應(yīng)，還可經(jīng)p38絲裂原活化蛋白激酶-自噬蛋白P62信號軸，通過c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）級聯(lián)活化方式誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬和炎性反應(yīng)，最終造成肝細(xì)胞損傷[10-12]。研究報道DMF暴露動物在出現(xiàn)消化道損害同時，可伴隨S24-7、類桿菌科、理肯菌科和消化鏈球菌科等菌群數(shù)量改變，并推測此現(xiàn)象可能會間接影響Toll受體相關(guān)信號而誘導(dǎo)肝腦損害[13-14]。但截至目前，對于TLR4是否在DMF所致肝損傷中發(fā)揮作用及其涉及的具體分子尚不清楚。

鑒于以上原因，擬通過動物實驗考察DMF對小鼠肝臟損害效應(yīng)表現(xiàn)及對TLR4相關(guān)分子表達(dá)的影響，借此探討DMF肝損傷的潛在機(jī)制與可能途徑，為DMF生態(tài)毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑與儀器

試劑：DMF（Assay LC-MS 98%，Sigma-Aldrich公司，美國）；RT-PCR試劑及引物（TaKaRa大連寶生物公司，中國）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒和堿性磷酸酶試劑盒（Applied Biosystems公司，美國）；白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-αElisa試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，中國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：5332型PCR儀（Eppendorf公司，德國）、MODEL550酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國）、RM2126切片機(jī)（Leica公司，德國）、CK40顯微鏡（Olympus公司，日本）、CFI60數(shù)碼相機(jī)（Nikon，日本）。

1.2 動物模型建立

雌雄各半ICR小鼠80只，雄性（23±2） g，雌性（20±2） g，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供（SCXK滬2008-0016），實驗室馴養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組（0 mg·kg-1·d-1,n=20）、低劑量組（350 mg·kg-1·d-1,n=20）、中劑量組（700 mg·kg-1·d-1,n=20）和高劑量組（1 400 mg·kg-1·d-1,n=20）。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 臟器系數(shù)

小鼠處死前稱量質(zhì)量，處死后用預(yù)冷生理鹽水漂洗肝臟，濾紙吸干稱取肝質(zhì)量計算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.2 肝臟病理觀察

肝臟組織用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋制備4 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）、油紅O染色后顯微鏡觀察其病理學(xué)變化。

1.3.3 肝臟組織勻漿中指標(biāo)的檢測

按照測試盒說明書進(jìn)行操作，測定肝臟組織勻漿中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性以及總膽固醇（total cholesterol, TC）和甘油三酯（triglyceride, TG）含量。

1.3.4 肝臟蛋白質(zhì)提取及蛋白印跡反應(yīng)（Western blotting, WB）

稱取約100 mg小鼠肝臟組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，置于95 ℃水浴鍋蛋白變性10 min，并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)實驗?zāi)康?，配制不同濃度的SDS-PAGE膠，80 V電壓下分離30 min左右，直至marker顏色分開，切換至120 V電壓直至結(jié)束，對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后，在濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液中將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇活化的PVDF膜上，100 V，濕轉(zhuǎn)70 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，加入適量含5%牛奶的TBST，室溫輕搖封閉1 h，結(jié)束后一抗4 ℃孵育過夜。次日，一抗回收，TBST清洗（5 min×3次）。HRP偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h，TBST清洗（5 min×3次）。用ECL發(fā)光液孵育約3 min，放入Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)拍攝，后用Image J軟件分析。

1.3.5 ELISA法測小鼠肝臟中炎性因子水平

稱取小鼠肝臟組織約100 mg勻漿，用ELISA法測試小鼠肝臟中炎性因子白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的活性。將試劑盒在室溫下放置20 min后，從鋁箔袋中取出所需板條。在標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣品孔按照說明書加入所需試劑及待測樣品，將帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體加入每個孔中，空白孔除外，然后用封板膜封住反應(yīng)孔并于恒溫箱溫育60 min或水浴鍋水浴37 ℃。棄去液體，殘余水分拍干后加入洗滌液，放置1 min，棄去洗滌液，拍干，重復(fù)洗5次。在每個孔中加入A液和B液，37 ℃避光孵育15 min后，加入終止液，于15 min內(nèi)在450 nm波長處測OD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果（Results）

2.1 DMF暴露對小鼠一般狀況的影響

DMF暴露小鼠均出現(xiàn)不同程度活動遲緩，伴隨毛發(fā)暗淡，脫毛。隨暴露劑量及周期增長，出現(xiàn)明顯易激惹，個別實驗動物出現(xiàn)腹瀉，鼻衄。

如表1所示，實驗第5周時，高劑量組小鼠體質(zhì)量（35.96±5.24） g與對照組（40.61±5.77） g相比開始出現(xiàn)顯著降低，低、中劑量組小鼠雖也出現(xiàn)了體質(zhì)量減少（（40.06±5.55） g、（38.81±5.29） g），但與對照組相比差異并不顯著。第12周時中、高劑量組小鼠體質(zhì)量分別為（41.82±6.12） g和（39.62±6.19） g，相比對照組（46.87±6.90） g分別降低了約10.79%和15.48% （P<0.05）。此同時，DMF暴露造成小鼠肝質(zhì)量的增加，不同劑量組小鼠肝臟系數(shù)與對照組相比均顯著增加（P<0.05），如表2所示。

2.2 DMF暴露對小鼠肝臟形態(tài)影響

對各組小鼠肝臟形態(tài)進(jìn)行比較，光鏡下HE染色如圖1所示，肝索排列整齊，細(xì)質(zhì)均勻，細(xì)胞核著色清晰可見，DMF暴露組可見不同程度炎細(xì)胞浸潤遷移，細(xì)胞空泡出現(xiàn)和細(xì)胞核偏移。油紅O染色結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，暴露組小鼠細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙充斥著大量脂肪滴。

2.3 DMF暴露對小鼠肝臟代謝酶水平影響

對DMF暴露后小鼠肝臟勻漿中肝功能相關(guān)酶活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果如表3所示，和對照組相比DMF暴露造成中、高劑量組ALT、AST和ALP含量顯著上升（P<0.05），其中ALT和AST隨暴露劑量增加而顯著上升。對肝臟代謝產(chǎn)物的檢測發(fā)現(xiàn)，TG和TC的水平都在DMF暴露組出現(xiàn)了增加，但TC僅在高劑量組出現(xiàn)顯著增高，其中高劑量組和低劑量組相比也表現(xiàn)出顯著的增加。

2.4 DMF暴露對小鼠肝臟中相關(guān)蛋白水平的影響

如圖3所示，通過對DMF暴露小鼠TLR4相關(guān)通路蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測發(fā)現(xiàn)，TLR4的表達(dá)隨著DMF劑量增加顯著上升，分別約是對照組的1.30倍、1.55倍和1.98倍，其下游分子Akt和NF-κB的磷酸化改變趨勢與之類似，均隨著DMF劑量的增加而顯著增高（P<0.05）。

2.5 DMF暴露對小鼠肝臟中炎癥因子的影響

如表4所示，ELISA結(jié)果顯示小鼠肝臟中炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α隨著DMF暴露劑量的增加而增加。與對照組相比，IL-1水平在中、高劑量組出現(xiàn)顯著升高，尤其高劑量組中達(dá)到最高，約為對照組4倍左右（P<0.05）。此外，和對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組IL-6活性分別升高約1.15倍、1.35倍和1.86倍，并有隨著劑量在組間逐漸上升的趨勢（P<0.05）。TNF-α水平在中、高劑量組相較對照組也分別升高約1.86倍和2.76倍（P<0.05）。

表1 二甲基甲酰胺（DMF）暴露對小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of N,N-dimethylformamide （DMF） exposure on body weight of mice

表2 DMF暴露對小鼠肝質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響Table 2 Effect of DMF exposure on liver weight and organ index of mice n=20）

圖1 DMF暴露后小鼠肝臟HE染色注：（a）、（b）、（c）和（d）分別代表對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組（×400），n=20；黑色箭頭表示空泡，紅色箭頭表示炎性細(xì)胞。Fig. 1 HE staining of mouse liver after DMF exposureNote: （a）, （b）, （c）, and （d） represent the control group, low-dose group, medium-dose group, high-dose group （×400）, n=20; the black arrows indicate vacuoles, and the red arrows indicate inflammatory cells.

圖2 DMF暴露后小鼠肝臟油紅O染色注：（a）、（b）、（c）和（d）分別代表對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組（×400），n=20；黑色箭頭表示脂肪滴。Fig. 2 Mice liver oil red O staining after DMF exposureNote: （a）, （b）, （c）, and （d） represent the control group, low-dose group, medium-dose group, high-dose group （×400）, n=20; the black arrow shows the fat drop.

3 討論（Discussion）

DMF屬于人類健康領(lǐng)域優(yōu)先研究的4種污染物之一，具有明顯的肝臟毒性，但具體機(jī)制未明[15]。本次實驗發(fā)現(xiàn)DMF能引起小鼠肝臟酶學(xué)及形態(tài)學(xué)的顯著改變，伴隨脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的水平升高，這與前人對不同途徑接觸DMF的嚙齒類及人、兔等種屬研究的結(jié)果類似[16-17]，提示亞慢性DMF暴露可造成以肝脂代謝紊亂為特征的肝損傷表現(xiàn)。為進(jìn)一步了解DMF毒效應(yīng)機(jī)制，對TLR4及相關(guān)分子表達(dá)進(jìn)行了檢測。

TLR4屬于宿主應(yīng)答反應(yīng)中的一種細(xì)胞表面受體分子，在天然免疫和炎癥反應(yīng)中具有中心樞紐作用[18]。除了其經(jīng)典配體脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）外，近年研究發(fā)現(xiàn)TLR4也可被包括環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在內(nèi)的多種外源化合物所響應(yīng)，通過識別病原相關(guān)分子模式及危險相關(guān)分子模式活化下游銜接分子如髓樣分化因子88、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白等，最終調(diào)節(jié)信號依賴性轉(zhuǎn)錄因子活性，參與后續(xù)肝臟炎性損傷，被認(rèn)為是急慢性肝損傷中重要一環(huán)[10-11, 19-21]。

TLR4的損傷效果與其對下游分子Akt的調(diào)控活化關(guān)系密切（圖4）。TLR4可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶調(diào)節(jié)亞基P85活化來上調(diào)Akt磷酸化水平?；罨腁kt通過上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c核積累、激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白受體、誘導(dǎo)肝X受體活化的方式上調(diào)脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶等表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)合成。研究發(fā)現(xiàn)野生型C3H/HeN小鼠和TLR4基因突變的C3H/HeJ小鼠相比具有更高的肝臟脂肪蓄積和炎性改變[22]。此外PM2.5暴露研究也發(fā)現(xiàn)TLR4可通過調(diào)節(jié)Akt反饋調(diào)節(jié)因子STAT3水平影響肝臟瘦素分泌，造成脂代謝異常[23-24]。反之，TLR4拮抗劑或敲除沉默均對緩解或阻斷與下游Akt相關(guān)的脂毒性反應(yīng)有效[25-26]。但同時作為增殖調(diào)控和糖脂代謝的交叉調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞代謝失衡可促使Akt招募活化IκB激酶（IκB kinase, IKK）復(fù)合物并降解NF-κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B, IκB），使其轉(zhuǎn)位入核調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎性免疫[27]。Shen等[28]通過藥物抑制TLR4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能緩解Akt/NF-κB激活的炎性反應(yīng)，從而降低大鼠卵巢細(xì)胞凋亡。此外TLR4下游分子MyD88的抑制劑可通過阻滯Akt磷酸化及下調(diào)IκB活性的方式減少NF-κB活化，抑制RAW 264.7細(xì)胞中LPS所引起的炎性損傷[29]。在本次實驗中隨著DMF暴露劑量的增加，TLR4表達(dá)水平出現(xiàn)明顯增加，同時伴隨下游Akt/NF-κB磷酸化水平的提升，與之同步的是血清中TG和TC的上升及肝細(xì)胞中脂滴數(shù)量的增加。由此推斷，DMF首先通過激活TLR4/Akt造成了脂代謝通路的亢進(jìn)，引起細(xì)胞中脂肪蓄積增多，正常情況下，肝系統(tǒng)通過加快轉(zhuǎn)運和脂肪酸氧化來對抗脂肪合成，但隨著血中游離脂肪酸水平及細(xì)胞脂變性加重超過機(jī)體代償，又作為外源性誘因刺激Akt加快上調(diào)NF-κB，觸發(fā)終末炎性反應(yīng)回路。

圖3 DMF對小鼠蛋白表達(dá)水平的影響注：*與對照組相比，P<0.05。Fig. 3 Effect of DMF on mouse protein expression level n=20）Note: *indicates P<0.05 compared with control group.

圖4 TLR4相關(guān)分子在DMF致小鼠肝損傷中的作用方式Fig. 4 TLR4 activation leading to liver injury with DMF exposure

表3 DMF暴露對小鼠血清肝代謝酶的影響Table 3 Effect of DMF on liver metabolic enzyme activity in serum of mice n=20）

表4 DMF對小鼠炎癥因子活性的影響Table 4 Effect of DMF on the activity of inflammatory factors in mice n=20） （pg·mL-1）

作為炎性網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，NF-κB活化后將通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控方式上調(diào)促炎細(xì)胞如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等的表達(dá)。作為最早最重要的炎癥介質(zhì)，TNF-α能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞促使白介素合成與釋放，生成的IL-1和IL-6不僅刺激T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌各種趨化因子，還能增加肝細(xì)胞合成急性期蛋白引起肝細(xì)胞凋亡[30]。與此同時，以上促炎因子也能介由二?；视秃蜕窠?jīng)酰胺等第二信使作用激活絲裂原活化蛋白激酶通路，反向上調(diào)NF-κB并形成炎性環(huán)路[31]。在前人開展的體外實驗中DMF可通過誘導(dǎo)高水平促炎因子如TNF-α、IL-1等分泌造成H9c2細(xì)胞凋亡，以往發(fā)現(xiàn)的DMF相關(guān)肝損傷模型中，同樣存在TNF-α、IL-1等的顯著上升[32-33]。據(jù)此有理由推斷DMF有能力通過上調(diào)TLR4/Akt/NF-κB途徑激活細(xì)胞炎性反應(yīng)，并形成NF-κB與促炎因子的自調(diào)節(jié)反饋環(huán)路，造成炎性關(guān)系網(wǎng)的惡性往復(fù)，延長炎性反應(yīng)時間，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和肝臟損傷的不良結(jié)局。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)DMF亞慢性暴露可造成ICR小鼠出現(xiàn)肝臟脂代謝紊亂、肝細(xì)胞凋亡，最終出現(xiàn)肝損傷的不良結(jié)局。我們推測DMF誘導(dǎo)TLR4的表達(dá)上調(diào)是這一現(xiàn)象的開端，此后TLR4通過上調(diào)Akt活性影響下游NF-κB相關(guān)的炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，造成肝臟免疫炎性調(diào)控失代償而最終導(dǎo)致肝臟損傷的結(jié)局。