林炫財,陳希玲,許森寶,白楊,張亞歷

【提要】 乳酸菌在食品工業(yè)中有著悠久的使用歷史，并且由于其安全性、內(nèi)在的有益健康效應和巨大的生物技術潛力，在治療中也呈現(xiàn)越來越大的吸引力。隨著黏膜免疫的發(fā)展，對乳酸菌表達系統(tǒng)的研究主要集中在不同位置抗原表達的遺傳工具的產(chǎn)生上。目前已知的能夠使用乳酸菌作為載體來遞送各種的治療分子，主要是通過分泌或表面展示，它們被用于治療或預防多種疾病：炎癥性腸病、感染、自身免疫性疾病，甚至癌癥。本文回顧了有關使用重組乳酸菌作為黏膜遞送載體和相關健康益處的相關數(shù)據(jù)，討論了它們用于遞送治療性蛋白質(zhì)的用途，同時也關注了治療性肽的遞送，重點是最常用的乳球菌屬和乳酸桿菌屬。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能分解碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌統(tǒng)稱，主要包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)及鏈球菌屬(Streptococcus)等43個屬。由于在人類營養(yǎng)中的長期安全使用，它們已被美國食品和藥物管理局認可為安全的，并且通常用作食品工業(yè)中的發(fā)酵劑。它們的安全狀態(tài)、益生菌活性和通過胃腸道(gastrointestinal tract，GIT)的存活能力使這些細菌成為治療分子黏膜靶向給藥的極好候選者。LAB的特定菌株被用作人類和動物健康的益生菌，因為它們可以通過產(chǎn)生生物活性代謝物、調(diào)節(jié)黏膜免疫和腸道通透性，在維持胃腸道穩(wěn)態(tài)和影響其他器官方面發(fā)揮著至關重要的作用[1]。重組LAB介導的黏膜疫苗遞送，特別是通過鼻腔或口服免疫，比傳統(tǒng)全身疫苗的靜脈或肌肉注射更適用和方便，同時，通過黏膜遞送可以增強慢性疾病和黏膜感染治療蛋白的效力和特異性。這種方法也可以減少與此類蛋白質(zhì)的經(jīng)典全身給藥途徑造成的相關潛在副作用[2]。

1 乳酸菌作為黏膜遞送載體的優(yōu)勢

近年來，黏膜給藥免疫因其卓越的特性和針對多種微生物病原體的應用而備受關注。除了激活適應性免疫反應外，它們還可以保護黏膜表面免受感染、防止抗原降解并促進GIT的吸收?？诜虮莾?nèi)施用的可溶性蛋白質(zhì)的免疫原性通常較低，而通過將蛋白質(zhì)耦聯(lián)至細菌表面或通過基因工程細菌產(chǎn)生所需抗原可顯著增強免疫原性。LAB是非病原微生物，被認為比某些減毒載體更安全，這使它們成為開發(fā)黏膜疫苗的有利候選者[3]。LAB可以在三個不同的細胞位置產(chǎn)生所需的抗原：①細胞內(nèi)，這使蛋白質(zhì)能夠逃脫惡劣的外部環(huán)境條件(例如極酸的胃液環(huán)境)，但需要細胞裂解才能使蛋白質(zhì)釋放和遞送，②細胞外，允許將蛋白質(zhì)釋放到外部介質(zhì)中，并且與環(huán)境(食品或消化道)直接相互作用，③細胞壁錨定，結合了其他兩個位置的優(yōu)點(即細胞壁錨定蛋白與環(huán)境之間的相互作用，以及防止蛋白降解)[4]。研究表明，通過暴露于LAB表面的細胞壁錨定抗原獲得的免疫反應較其他兩種方式更優(yōu)[5]?？诜﨤AB可以在暴露于胃酸和與膽汁接觸后存活下來，從而被吸收到黏膜免疫系統(tǒng)的誘導位點，例如派爾集合淋巴結。此外，通過口腔、鼻內(nèi)或生殖器途徑對LAB進行黏膜給藥可以刺激黏膜和全身免疫反應。它們引發(fā)分泌型IgA產(chǎn)生的能力是LAB作為黏膜疫苗的主要優(yōu)勢之一[6-7]。目前，許多抗原和/或細胞因子已在重組LAB中成功表達，并且這些重組LAB的黏膜給藥已被證明可引發(fā)全身和黏膜免疫。

2 重組乳酸菌應用于疾病治療和預防

2.1 炎癥性腸病

炎癥性腸病(inflammation bowel disease，IBD)，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn's disease，CD)，是一種慢性炎癥性疾病，其特征是胃腸道中的免疫反應失調(diào)，癥狀包括腹痛、腸痙攣、腹瀉、疲勞、發(fā)燒、體重減輕和食欲不振等。皮質(zhì)類固醇、硫嘌呤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α ,TNF-α)抗體可用于治療IBD。其中TNF-α是最有效的，但會導致嚴重的副作用并且成本高。第一次報道使用重組LAB治療IBD是2000發(fā)表的，Steidler等[8]人描述了分泌型白介素(Interleukin，IL)-10重組乳球菌在兩種結腸炎小鼠模型中的應用，而后有幾項研究同樣使用重組乳球菌遞送IL-10。結果共同表明，口服重組乳球菌分泌IL-10可降低腸道通透性、改善腸道功能障礙并增強小鼠的免疫功能，重組乳球菌顯著緩解了結腸炎小鼠的腸道炎癥[9-10]。Henri Braat等[11]人使用IL-10重組乳球菌進行了小型I期臨床試驗，結果表明該策略對患者來說既安全又具有生物學意義。Motta等[12]人的研究表明，在急性和慢性結腸炎的小鼠模型中，口服表達絲氨酸蛋白酶抑制劑-彈性蛋白酶抑制劑(Elafin)的乳酸菌可降低腸道炎癥并恢復腸道穩(wěn)態(tài)。Humaran等[9]人比較了分泌①IL-10或TGF-β1作為抗炎細胞因子，以及分泌②Elafin或白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的不同重組乳球菌對IBD模型小鼠的功效，結果表明，在該IBD模型小鼠中，使用表達抗蛋白酶(Elafin或SLPI)的乳球菌比使用表達抗炎細胞因子(IL-10或TGF-β1)的乳球菌在減少腸道炎癥方面更有效。krlec等[13]人研究發(fā)現(xiàn)，分泌BPC-157的乳球菌能顯著降低成纖維細胞模型中活性氧簇的產(chǎn)生，表明其在治療腸道炎癥方面的潛在益處。Wong等[14]人發(fā)現(xiàn)，在乳球菌中表達的組織蛋白酶抑制素(Cathelicidin)可以有效地恢復結腸炎小鼠的黏膜完整性并增強炎癥結腸組織的黏膜修復。Shigemori等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，口服分泌白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)的重組乳球菌可抑制急性結腸炎小鼠的體重減輕和降低疾病活動指數(shù)評分。Liu等[16]人發(fā)現(xiàn)，口服分泌胰島素樣生長因子I(IGF-I)的重組LAB可減輕結腸炎模型小鼠的癥狀和疾病發(fā)展。

2.2 感染

重組LAB介導的黏膜疫苗遞送，特別是通過鼻腔或口服免疫，比傳統(tǒng)全身疫苗的靜脈或肌肉注射更適用和方便，同時，通過黏膜遞送可以增強慢性疾病和黏膜感染治療蛋白的效力和特異性。在過去的研究中已經(jīng)構建了不同的重組LAB來傳遞來自病毒、細菌、真菌或寄生蟲病原體的抗原，目的是針對感染進行黏膜接種[17]。Wells等[18-19]人使用活的乳球菌遞送疫苗抗原。他們構建了表達破傷風毒素片段C(TTC)的重組乳球菌，通過比較口服和鼻腔給藥產(chǎn)生TTC的活乳球菌，觀察對小鼠產(chǎn)生的保護效果。結果發(fā)現(xiàn)，雖然保護功效相同，但鼻腔免疫比口服給藥引起更高水平的血清IgG和黏膜IgA。Wang等[20]人研究表明，將表達高致病性禽流感病毒蛋白血凝素-1(HA-1)的乳酸桿菌口服給藥于正常小鼠，最終提高了黏膜中特異性抗HA-1 IgA抗體和血清中IgG的產(chǎn)生，以及脾臟T淋巴細胞的增殖反應。在一項針對禽流感病毒(AIV)的口服疫苗試驗中，Shi等人通過將表達H9N2 AIV的HA基因的重組乳酸桿菌(NC8)口服給藥于小鼠，發(fā)現(xiàn)重組NC8菌株能誘導小鼠黏膜和全身免疫反應，促使sIgA、IgG和血凝抑制抗體的產(chǎn)生，并對小鼠遭受H9N2病毒攻擊時提供免疫保護[21]。Zhou等[22]人通過給雞口服表達H9N2 M1-HA2融合蛋白的乳球菌菌株，最終發(fā)現(xiàn)該重組菌株可以很好的誘導黏膜保護功能和全身免疫。Belkis Marelli等[23]人構建了產(chǎn)生輪狀病毒刺突蛋白亞基VP8的重組乳球菌菌株，給小鼠口服后其體內(nèi)產(chǎn)生顯著水平的腸道IgA抗體，并且觀察到實驗組小鼠比對照組明顯阻斷了輪狀病毒感染。Berlec等人[24]構建了表達高免疫原性HAV抗原VP1-P2a的乳球菌，結果表明該抗原在乳球菌中成功表達，并在小鼠口服后引起顯著的全身體液免疫反應，但實驗組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的IgG不能中和HAV，表明特定的IgG不能結合病毒顆粒并阻止它們感染靶細胞，這需要進行后續(xù)的研究。Lin等人[25]構建了分泌外源性導管素的重組乳球菌，研究結果表明口服重組菌小鼠顯著增加了黏膜導管素水平并減少了幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染和相關炎癥。Zhang等人[26]構建了攜帶來自H.pylori的Lpp20基因的工程化乳球菌，并且證明該工程菌株誘導血清IgG水平顯著升高，表明Lpp20通過重組乳球菌傳遞，可以有效地轉移到黏膜免疫位點并引發(fā)顯著的免疫反應。Soodabeh等人[27]構建了分泌I型菌毛黏附素(FimH)的重組乳球菌，體外實驗表明重組乳球菌的生物膜可以顯著減少泌尿病原體生物膜的形成，并且體內(nèi)實驗表明經(jīng)尿道給予重組乳球菌能明顯抑制尿路致病性大腸桿菌定植和降低尿路感染的風險。盡管黏膜疫苗接種作為針對多種抗原的抗感染方法具有獨特的優(yōu)勢，但這些疫苗中的大多數(shù)仍處于實驗階段，目前只有少數(shù)被批準用于人類和動物用途。

2.3 自身免疫性疾?。哼^敏和糖尿病

LAB在治療過敏癥和I型糖尿病中的應用已得到廣泛研究。通過黏膜途徑致敏比皮下注射有兩個優(yōu)點，即口服給藥和提高有效性。過敏原特異性免疫療法是目前治療過敏性疾病的有效治療方法，但它需要在3～5年內(nèi)重復施用過敏原提取物，并且通常會引起不良事件的發(fā)生。許多益生菌菌株在過敏性疾病的治療中顯示出有益的作用，目前已陸續(xù)出現(xiàn)了表達相關過敏原的重組LAB，用于產(chǎn)生和/或遞送過敏原或過敏原衍生肽至黏膜表面以誘導耐受性[28]。在Kayo等人[29]的一項研究中，表達日本雪松花粉過敏原Cryj1的重組乳酸桿菌口服給雪松花粉癥的小鼠模型，結果表明，使用攜帶Cryj1的乳酸桿菌進行口服疫苗接種可改善雪松花粉癥小鼠模型的鼻部癥狀以及產(chǎn)生過敏原特異性IgE反應。而Minic[30]等人則將Fes p1過敏原共價連接到植物乳桿菌細胞壁上，其在小鼠模型中的作用評估表明，口服重組和非重組活植物乳桿菌都減少外周血嗜酸性粒細胞并增加血清IgG2a水平，這可能是植物乳桿菌本身的作用，而用重組乳桿菌治療的小鼠血清IgA水平明顯增加，表明重組植物乳桿菌表達的Fes p1可作為特異性過敏原并增強了有益的治療效果。同樣，一項研究將塵螨過敏原Der p2重組到乳球菌上，并通過口服重組菌的方式在Der p2致敏BALB/c小鼠模型中評估了它們的保護作用。結果實驗組小鼠明顯降低IgE水平并減少了由Der p2引起的肺部炎癥反應。同時也說明血清中特定IgG2a的增加和腸系膜淋巴結中調(diào)節(jié)性T細胞的增殖與保護性黏膜反應相關[31]。

除了過敏，重組LAB被認為是I型糖尿病現(xiàn)有療法的潛在替代品，I型糖尿病也是一種自身免疫性疾病，其特征是致病性自身反應性T細胞選擇性破壞產(chǎn)生胰島素的胰腺β細胞。它通常通過基于抗體的免疫療法和免疫抑制藥物進行管理。然而，這些藥物無法區(qū)分自身和非自身免疫效應物。因此，基于抗原的免疫療法被認為是治療自身免疫疾病最有潛力的方法，此療法可選擇性地作用于疾病相關的T細胞并具有保護免疫系統(tǒng)的功能[32]。Ma等人[33]發(fā)現(xiàn)，口服表達融合蛋白HSP65-6P277重組乳球菌的非肥胖糖尿病小鼠，可預防高血糖、改善葡萄糖耐量和減少胰島炎癥。Robert等人[34]的研究中，他們構建了分泌谷氨酸脫羧酶(GAD)-65和IL-10的乳球菌，通過口服給藥，最終穩(wěn)定了近期發(fā)病的非肥胖糖尿病小鼠的胰島炎癥、保留了功能性β細胞質(zhì)量，并使小鼠恢復了正常血糖。 另一項研究中，Takiishi等人[35]構建了分泌人胰島素原(PINS)和IL-10的重組乳球菌，給新發(fā)病的糖尿病小鼠口服重組乳球菌并給予亞治療劑量的抗CD3抗體，結果表明，66%的小鼠在治療后恢復正常血糖，該效果顯著優(yōu)于僅用抗CD3治療的的小鼠(43%)，而單純口服重組乳球菌的實驗組則為17%，其中對照組小鼠為0%?？傊?，使用重組乳球菌菌株是治療自身免疫性疾病的潛在有效策略，但仍需行進一步的研究。

2.4 癌癥

癌癥是威脅人類健康的一大殺手，嚴重影響人類生活質(zhì)量。癌癥的進展與慢性炎癥有關；因此，用于治療癌癥的重組LAB主要旨在減少炎癥的進展?；钚匝跷镔|(zhì)例如過氧化氫，參與結腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)展的各個方面。降低它們的水平可能是預防結腸癌的一種有效方法，Alejandra等人[36]進行一項研究，目的是評估分泌過氧化氫酶的重組乳球菌對預防實驗性小鼠1,2-二甲基肼誘導的結腸癌的影響，結果發(fā)現(xiàn)口服重組菌能夠增加實驗小鼠體內(nèi)的過氧化氫酶活性，從而減少結腸炎癥和損傷。Tina等人[37]構建了表達癌癥相關上皮細胞黏附分子(EpCAM)和人表皮生長因子受體2(HER2)融合蛋白的重組乳球菌，并在體外證實了重組乳球菌黏附在具有過度表達腫瘤抗原的HEK293細胞，另一方面，沒有觀察到該重組菌與沒有腫瘤抗原表達的HEK293細胞結合，證實了工程化乳球菌的選擇性。Carmen等人[38]構建了表達抗氧化酶(過氧化氫酶或超氧化物歧化酶)或IL-10的重組LAB，并通過體內(nèi)實驗證明，口服重組菌的結腸癌模型小鼠顯示出較少的微觀腸道損傷，說明該輔助治療可用于緩解與結直腸癌相關的炎癥環(huán)境。E.Bohlul等人[39]構建了表達腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)蛋白的重組乳球菌。研究表明，產(chǎn)生TRAIL蛋白的重組乳酸球菌可誘導人結腸癌細胞系SW480和HCT116細胞凋亡。且Kaczmarek等人[40]后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，口服二甲雙胍進一步增強了重組乳球菌分泌TRAIL的這種體內(nèi)抗腫瘤活性。另一方面，針對宮頸癌，Li等人[41]構建了攜帶人乳頭瘤病毒E7蛋白和IL-12 DNA的乳球菌，通過鼻內(nèi)給藥的方式，發(fā)現(xiàn)在注射了表達E7的腫瘤細胞系(TC-1)的小鼠中，實驗組比對照組腫瘤生長明顯受抑制，說明重組菌能夠有效引發(fā)抗原特異性免疫反應。Kawana等人[42-44]通過口服分泌突變的HPV16 E7蛋白的重組乳酸桿菌進行了為期8周的觀察性1/2a期臨床試驗，結果表明，口服分泌HPV16 E7重組菌可增加血清HPV16 E7特異性抗體的產(chǎn)生，從而誘導保護性體液免疫，并且該免疫方式是安全的。Mohseni等人[45]則構建了分泌突變的HPV16 E7蛋白的乳球菌，并且證明了口服重組菌的C57BL/6小鼠體內(nèi)，抗原刺激的脾細胞和腸黏膜淋巴細胞中分泌HPV-16 E7特異性IL-2和IFN-γ的T細胞顯著高于對照組，說明接種重組菌的小鼠能夠?qū)C-1細胞的攻擊產(chǎn)生有效的保護作用。Sedigheh等人[46]構建了分泌突變的HPV16 E6蛋白的乳球菌，實驗證明，乳球菌展示的E6蛋白可以誘導體液和細胞免疫，對腫瘤大小進展具有一定抑制作用。

2.5 其他疾病

近年來，也有研究者嘗試用重組LAB作為藥物分子的投遞載體防治2型糖尿病。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種由腸細胞產(chǎn)生的腸促胰島素，以葡萄糖依賴性方式刺激胰腺分泌胰島素，外源供應的GLP-1類似物用于治療2型糖尿病。Agarwal等人[47]構建了表達 GLP-1的重組乳球菌，該重組菌灌胃大鼠后的2～11 h，大鼠的胰島素水平顯著增加，血糖水平顯著降低，表明重組的乳球菌表達出了具有功能活性的GLP-1。Exendin-4是一種GLP-1受體激動劑，Zeng等[48]使用了重組乳球菌載體表達Exendin-4，研究發(fā)現(xiàn)重組乳球菌能夠顯著促進胰島β細胞INS-1分泌胰島素和促進胰島細胞增殖。此外，Kaja等人[49]運用重組乳球菌治療多發(fā)性硬化癥，他們構建了產(chǎn)生髓鞘肽的重組乳球菌，通過口服給藥過敏性腦脊髓炎模型大鼠，結果發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠血清IL-1b、IL-10和TNF-α的水平明顯降低。Guilherme等人[50]構建了分泌Hsp65的重組乳球菌，Hsp65在炎癥組織中過度表達，能夠誘導免疫調(diào)節(jié)機制，實驗結果發(fā)現(xiàn)，用產(chǎn)Hsp65的乳球菌口服治療可防止模型小鼠關節(jié)炎的發(fā)展。這種效應與通過喂食Hsp65在腸道中觸發(fā)的耐受機制有關。

3 總結

LAB表達系統(tǒng)的發(fā)展促進了旨在確定表達抗原(細胞質(zhì)、分泌或細胞壁錨定)的細胞定位以及定位對其免疫原能力的影響的研究。在表面表達抗原的LAB可能比那些表達細胞質(zhì)抗原的LAB表現(xiàn)出更顯著的免疫學效應，因為細胞表面抗原具有直接與環(huán)境相互作用并避免蛋白水解降解的能力。在某些情況下，由于避免暴露于惡劣的環(huán)境條件，細胞內(nèi)抗原比在其他位置表達的抗原更具免疫原性[1, 51]。在給藥方式上，不同的黏膜給藥途徑引起不同的免疫作用。大多數(shù)研究表明鼻內(nèi)給藥比胃內(nèi)途徑能更有效地誘導全身反應，滅活的重組LAB更適合鼻內(nèi)接種[52-53]。胃內(nèi)免疫則更方便、經(jīng)濟，更適用于動物飼料業(yè)務。盡管重組LAB應用前景廣闊，仍存在安全性、穩(wěn)定性、持久性等問題亟待解決。為了改進使用LAB作為載體的療法設計，未來應解決以下問題：①不同治療分子在重組LAB中的共表達；②選擇持久性LAB物種，尤其是乳酸桿菌屬；③開發(fā)合適的黏膜遞送系統(tǒng)，包括理想的抗原遞送系統(tǒng)和特定佐劑；④高效表達系統(tǒng)的設計。在不久的將來，更多的研究和臨床試驗將促進重組LAB作為一種新的治療方法來預防和治療各種人類疾病。