喬 婷,李峻志,戴 璐,賀曉龍,趙瑞華,高小朋**
(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 延安 716000;2.陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)
羊肚菌(Morchella spp.)是一種珍稀的食藥兼用真菌,隸屬于子囊菌門(Asomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目 (Pezizales)羊肚菌科 (Morchellaceae),其風(fēng)味獨特,富含多種活性物質(zhì),在世界范圍內(nèi)具有很高的科學(xué)價值和經(jīng)濟價值[1]。據(jù)報道,羊肚菌的栽培是近100多年來的研究熱點,很早以前就有過關(guān)于食用野生羊肚菌的相關(guān)記錄,隨著其營養(yǎng)價值逐漸被發(fā)現(xiàn),研究人員開始深入研究羊肚菌的生態(tài)分布特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、人工栽培技術(shù)以及食(藥)用功效等[2-3]。但是對于羊肚菌分類鑒定方法和科學(xué)的人工栽培技術(shù)研究一直都備受爭議。因此,通過對目前羊肚菌的分類鑒定方法及人工栽培技術(shù)(主要包括菌種和外源營養(yǎng)兩大難題)進行綜述,以期為羊肚菌的優(yōu)良種質(zhì)資源開發(fā)和人工栽培技術(shù)研究提供科學(xué)思路,為產(chǎn)業(yè)的良性健康發(fā)展奠定扎實的理論基礎(chǔ)。
早期研究主要是依據(jù)宏觀和微觀形態(tài)特征對羊肚菌屬進行分類。宏觀特征主要包括菌蓋、菌柄、子囊果的形狀、大小、顏色,菌蓋與菌柄交界處的特征,脊和凹坑的排列、形態(tài)、顏色等;微觀方面主要包括子囊的形狀、分布特征,子囊孢子和側(cè)絲的形狀、直徑、顏色,剛毛的形態(tài)、大小,菌蓋上是否有絨毛、菌柄上是否有顆粒附著物以及其形態(tài)和大小等。此外,羊肚菌不同時期菌絲的形態(tài)特征、孢子印顏色、菌核的形態(tài)、形成時間以及在培養(yǎng)基上的分布特征等,都可以輔助進行羊肚菌的形態(tài)學(xué)分類[4]。在英國真菌索引數(shù)據(jù)庫(Index Fungorum)中,羊肚菌屬記錄有350個名稱物種,去除同物異名的情況,全球可能有近150個形態(tài)學(xué)物種[5]。根據(jù)羊肚菌菌蓋顏色、棱紋走向、菌蓋凹陷深淺及形狀、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋近中部與菌柄是否分離等特征,將羊肚菌分為黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類及半開羊肚菌類共3個形態(tài)分類單元[6-9]。根據(jù)成熟時子囊果的子實層和菌柄變紅與否提出了第四個類群,即變紅羊肚菌類群[10]。最新研究證明,使用復(fù)水、脫水、臨界點干燥制備技術(shù)對羊肚菌子囊孢子進行掃描電子顯微鏡(SEM)成像,可以提高孢子壁表面的分辨率,從而增加形態(tài)學(xué)特征的數(shù)量[11]。羊肚菌表型特征往往與地理發(fā)生或生態(tài)學(xué)相輔相成,特別是與特定喬木或灌木的假定關(guān)系,有時也可以提供形態(tài)分類信息[12]。但可用于羊肚菌屬物種形態(tài)學(xué)分類的特征較少,且同一物種內(nèi)形態(tài)學(xué)特征差異較大,形狀、顏色和大小又會隨著環(huán)境、地理位置的變化發(fā)生改變,甚至在不同生長階段都存在較大差異,因此造成羊肚菌同物異名和同名異物的現(xiàn)象頻出[13-14]。
系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分子鑒定是以DNA序列為特征,通過測定一個或者幾個標(biāo)準的目的基因,如真菌中的ITS、LSU等DNA序列,來進行物種多樣性分析以構(gòu)建正確的物種鑒定體系[4]。截止2010年,羊肚菌屬的分子系統(tǒng)標(biāo)記以核糖體DNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)為主;之后,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,多基因聯(lián)合分析技術(shù)形成,可通過多個基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,比較其拓撲學(xué)關(guān)系,并以此界定物種[15],截至目前,該方法一直是羊肚菌分類研究的主要方法。
1.2.1 單基因測序
在過去很長一段時間中,ITS被用作分析環(huán)境樣本中真菌多樣性的靶標(biāo),ITS序列分析技術(shù)廣泛用于真菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,但基因庫(Gen-Bank)中ITS數(shù)據(jù)來源廣泛,其命名的準確性直接影響基于ITS序列分析的鑒定結(jié)果[16]。此外,有學(xué)者通過研究國際序列數(shù)據(jù)庫,估計了真菌界目前可獲得的所有真菌種內(nèi)ITS變異性;在數(shù)據(jù)庫內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了巨大的差異,其結(jié)果難以將分類單元的分類隸屬關(guān)系或營養(yǎng)模式相關(guān)聯(lián);而對于種內(nèi)變異,似乎沒有一個統(tǒng)一而嚴格的上限適用于整個真菌界,例如典型的3%閾值。因此,不應(yīng)使用簡化的方法來實現(xiàn)基于ITS的物種界定[17]。
1.2.2 多基因聯(lián)合測序
鑒于此,研究人員在ITS序列分析的基礎(chǔ)上,通過增加LSU、rpb1、rpb2和tef1多個基因的DNA序列來界定物種,使分類與鑒定結(jié)果更加科學(xué)和客觀[18]。研究結(jié)果證實,如使用單一的ITS序列鑒定羊肚菌屬物種,僅有約76%的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種可以被識別;而利用4基因進行聯(lián)合分析(ITS+tef1+rpb1+rpb2),則可以鑒定出該屬的所有物種[19-20]。在此研究基礎(chǔ)上,研究人員提出羊肚菌屬由黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)、黑色羊肚菌支系(Elata Clade)和變紅羊肚菌支系 (Rufobrunnea Clade)構(gòu)成[21],這一結(jié)論較形態(tài)學(xué)分類更加準確。隨著羊肚菌分類研究的深入,羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Morchella Multilocus Sequence Typing,Morchella MLST)[20]應(yīng)運而生,這一數(shù)據(jù)庫的建立為研究人員更加準確地鑒定羊肚菌提供了便利。截止目前,該數(shù)據(jù)庫包含了分別為ITS、LSU、rpb1、rpb2和tef1等5個片段的2 406條羊肚菌基因序列,其中羊肚菌研究專家提供了2 160條序列,另外246條序列來源于GenBank且已被證明其準確無誤。相關(guān)學(xué)者可以通過該數(shù)據(jù)庫獲得羊肚菌序列數(shù)據(jù)、相應(yīng)的物種名稱及館藏標(biāo)本或培養(yǎng)物等信息,同時也可以向該網(wǎng)站提供有關(guān)羊肚菌的可靠的DNA序列數(shù)據(jù)[22]。
目前,影響羊肚菌人工栽培成功與否的因素較多,主要包括栽培品種的選擇、栽培季節(jié)的安排、制種技術(shù)、播種技術(shù)、營養(yǎng)袋技術(shù)、環(huán)境調(diào)控技術(shù)等,但菌種技術(shù)和外源營養(yǎng)補料技術(shù)仍然是影響我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展的兩項關(guān)鍵因素[23-24]。
2.1.1 菌種
菌種幾乎是所有食用菌栽培的關(guān)鍵,菌種的質(zhì)量差異直接影響著栽培的成功與否。而羊肚菌是一種生活史較為復(fù)雜的子囊菌,從初期子囊孢子萌發(fā)成菌絲體,菌絲生長后期通過緊密連接交織形成休眠體結(jié)構(gòu)“菌核”,到最終形成子囊果從而又產(chǎn)生分生孢子,其機制可能與遺傳背景、發(fā)育和環(huán)境條件等密切相關(guān)。且由于羊肚菌的菌核沒有明顯的菌核結(jié)構(gòu)特征,又被稱為“假菌核”。研究表明,羊肚菌菌核的形成情況與菌種的活力、純度、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基配方等密切相關(guān)[25-26]。最新研究檢測出只有一種交配型基因存在于羊肚菌菌核中,因此可考慮將其作為選育菌種的材料,但菌核與羊肚菌子實體的形成以及產(chǎn)量之間的關(guān)系有待進一步研究[27]。此外,羊肚菌栽培過程中會產(chǎn)生大量的分生孢子,最新研究成果表明,羊肚菌分生孢子由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生,部分分生孢子包含1個~3個核;結(jié)合相關(guān)研究成果推測,分生孢子可能通過3種途徑參與羊肚菌子實體的形成過程,極有可能是作為精子細胞提供相反的交配型基因,也可能萌發(fā)成雌雄同體的兼性菌絲體,或作為生殖繁殖體參與其生殖過程;但羊肚菌分生孢子的發(fā)生與子實體形成以及是否為栽培中必不可少的階段仍舊沒有定論[28-29]。由于目前對羊肚菌復(fù)雜的生物學(xué)基礎(chǔ)研究較少,嚴重制約了羊肚菌野生品種馴化以及新品種選育的進度。因此,目前人工栽培的羊肚菌品種仍然集中在黑色類群中,包括梯棱羊肚菌(M.importuna)、六妹羊肚菌(M.sextelata)、七妹羊肚菌(M.exima)、頭絲羊肚菌(M.exuberans)、歐氏羊肚菌(M.owneri)、Mel-13和Mel-21在內(nèi)的7個系統(tǒng)發(fā)育種,其中以六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌栽培規(guī)模最大[30]。而其他品種的羊肚菌是否可以進行人工栽培尚不清楚,有待進一步研究[31]。
系統(tǒng)科學(xué)的羊肚菌菌種質(zhì)量評價體系對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必不可少,但羊肚菌菌絲體的形態(tài)特征隨著培養(yǎng)基的變化表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,這無形中提高了菌種質(zhì)量評價的難度[32-33]。因此,我國尚無明確的羊肚菌菌種質(zhì)量標(biāo)準,大部分菇農(nóng)僅根據(jù)菌核數(shù)量來判斷羊肚菌菌種質(zhì)量。最新研究表明,通過對羊肚菌菌株分類地位、交配型基因、菌株活力綜合評估,可確保菌株在人工栽培過程中表現(xiàn)出優(yōu)良、穩(wěn)定的性狀[34]。另一方面,菌種老化是羊肚菌栽培過程中的普遍現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌種老化與頻繁地傳代培養(yǎng)、不當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和保存條件、或營養(yǎng)環(huán)境不匹配相關(guān)[35];也有研究表明羊肚菌菌種老化機制與線粒體活性相關(guān),但對于指導(dǎo)生產(chǎn)來說還是缺乏系統(tǒng)的研究[36]。目前生產(chǎn)者對于此問題的解決辦法是反復(fù)從孢子培養(yǎng)物中重新選擇菌種,但依然難以保證菌種的穩(wěn)定性[37]?;诖?,研究人員只有通過選育多個性狀優(yōu)良、產(chǎn)量穩(wěn)定、可人工栽培的品種,同時深入研究羊肚菌菌種老化以及菌種與子實體形成之間的內(nèi)在機制,才能加快羊肚菌人工栽培技術(shù)的發(fā)展。
2.1.2 外源營養(yǎng)
外源營養(yǎng)袋技術(shù)的發(fā)展,較好地解決了羊肚菌人工栽培過程中營養(yǎng)補給這一難題,我國研究人員經(jīng)過數(shù)十年的科研和實踐,使該技術(shù)日趨成熟。但在外源營養(yǎng)袋的使用過程中,菇農(nóng)們對于營養(yǎng)袋的科學(xué)配比、制作技術(shù)、放置時間、數(shù)量以及撤袋時間等仍眾說紛紜,因此營養(yǎng)袋作用機制的研究尤為重要[24,38]。
外源營養(yǎng)袋技術(shù)是羊肚菌栽培過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),只有準確地掌握其制作和使用的技術(shù)要點,才能提高出菇的質(zhì)量和產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn),外源營養(yǎng)袋的配比與羊肚菌的出菇周期、產(chǎn)量呈正相關(guān)性,如按照小麥58%、闊葉樹木屑30%、腐質(zhì)土10%、石膏1%、石灰1%的配比,既有利于縮短梯棱羊肚菌的出菇周期,也可以提高產(chǎn)量;放置外源營養(yǎng)袋時,采用“一”字形狀的劃口,有利于降低污染率、提高產(chǎn)量[39]。研究人員通過檢測并分析了7種常見食用菌栽培原料的化學(xué)成分,結(jié)合栽培試驗驗證,探究了羊肚菌栽培產(chǎn)量背后的營養(yǎng)袋化學(xué)成分差異效應(yīng),為現(xiàn)有的營養(yǎng)袋配方提供了理論支撐[40]。另外,通過研究營養(yǎng)袋相關(guān)因素對羊肚菌生長的影響,發(fā)現(xiàn)施放營養(yǎng)袋時間與出菇期呈正比,營養(yǎng)袋中麥粒含量與子實體產(chǎn)量也呈正比[41]。也有研究發(fā)現(xiàn),外源營養(yǎng)袋的重量變化量和子實體產(chǎn)量成正相關(guān);當(dāng)外源營養(yǎng)袋重量減輕>50%,羊肚菌產(chǎn)量才可以達到正常產(chǎn)量(2 250 kg·hm-2)以上[42]。
有研究通過使用放射性標(biāo)記發(fā)現(xiàn),在羊肚菌營養(yǎng)生長過程中,從營養(yǎng)豐富到營養(yǎng)貧乏環(huán)境的改變,可以誘導(dǎo)真菌進入生殖生長周期,在此周期中形成子囊果[43-46]。為了研究羊肚菌的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運機制,Amir等[47]用細胞壓力探針測定了分割平板培養(yǎng)羊肚菌時菌絲和菌核中膨壓的變化;對于包括羊肚菌在內(nèi)的形成菌核的真菌,菌絲的生長、菌核的形成和發(fā)育過程中,存在著菌絲和菌核的變化以及兩者之間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運;影響物質(zhì)轉(zhuǎn)運的因素包括培養(yǎng)基的水勢梯度和菌絲、菌核的代謝活性及其膨壓差[48]。為了研究羊肚菌的分解及營養(yǎng)運輸機制,研究人員對一株可人工栽培的羊肚菌進行了基因組測序,并鑒定了營養(yǎng)袋分解裝置的編碼基因;然后用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù),分析編碼后碳水化合物活性酶(CAZymes)的表達情況;結(jié)果表明,羊肚菌營養(yǎng)菌絲體定植于外源營養(yǎng)袋上,釋放出一系列降解酶,有效分解和代謝多糖,如小麥和稻殼中的淀粉和纖維素;經(jīng)此分解機制釋放的代謝產(chǎn)物運輸?shù)骄哺浇耐寥辣韺樱M而誘發(fā)子實體形成;該發(fā)現(xiàn)有助于更詳細地描述誘發(fā)羊肚菌子實體形成的分子機制[49]。
2.2.1 大田栽培模式
隨著羊肚菌人工栽培技術(shù)的日益成熟,我國在田間和林下栽培羊肚菌的規(guī)模迅速擴大。其中大田栽培主要包括田地的選擇與整理、菌種制備、播種、補料技術(shù)、保育催菇、出菇管理和采收干制等主要環(huán)節(jié)。為了降低生產(chǎn)成本,合理利用林木資源和土地空間,學(xué)者和菇農(nóng)也嘗試通過模擬自然環(huán)境林下栽培羊肚菌,并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),羊肚菌林下設(shè)施栽培中,在栽培床上方采取“搭建小弓棚+覆蓋薄膜”的方式,比單純覆蓋遮陽網(wǎng)的方式產(chǎn)量更高[50]。
2.2.2 設(shè)施化栽培模式
由于羊肚菌大田露天栽培易受氣候和土壤的強烈影響,風(fēng)險較大;如2021年氣候反常,全國冬季平均氣溫集中在4℃~12℃,導(dǎo)致多地出菇過早,羊肚菌的營養(yǎng)生長還未達到生理成熟,同時由于溫差變化較大,發(fā)生大面積死菇,給羊肚菌栽培者造成巨大損失[51]。隨著產(chǎn)業(yè)大規(guī)模發(fā)展,為了減少自然氣候條件對羊肚菌栽培造成的影響,近幾年越來越多的從業(yè)者開始摸索適宜當(dāng)?shù)貧夂驐l件的設(shè)施化栽培模式。所謂設(shè)施化栽培,主要是通過機械設(shè)備干預(yù),采用工程技術(shù)手段,創(chuàng)建適宜羊肚菌生長的氣候條件。根據(jù)地域差異,目前羊肚菌設(shè)施栽培主要以“南方冷棚、北方暖棚”2種模式為代表[52]。
1)南方冷棚
南方地區(qū)的冷棚以簡易的塑料大棚為代表,用鍍鋅鋼架為主要材料,棚頂覆蓋塑料薄膜。冷棚搭建成本低、速度快、使用方便[53]。但冷棚栽培羊肚菌的周期較長,一般需要經(jīng)過5個月~6個月的管理,才可以出菇。
2)北方暖棚
為了抵御惡劣氣候環(huán)境的影響,北方暖棚多為半拱形,呈坐北朝南建設(shè)[54]。暖棚羊肚菌栽培一般從11月上旬開始播種,經(jīng)過菌絲著床萌發(fā)、地表菌霜形成、菌霜消失,共計需要50 d~60 d,次年元旦前后進行出菇管理,栽培周期相對較短[55]。
2.2.3 工廠化栽培
雖然以上2種模式從某種程度上可以保證羊肚菌人工栽培的成功率,但無法實現(xiàn)羊肚菌的周年化栽培,因此研究人員在室內(nèi)工廠化栽培方面不斷地探索,并取得一定成效。
美國Garry Mill早在1982年就進行了羊肚菌工廠化栽培的研究,并于2005年獲得成功,使整個栽培周期只需要70 d[38],這是世界上迄今為止唯一實現(xiàn)羊肚菌工廠化栽培的典型。而在我國食用菌產(chǎn)業(yè)快速工業(yè)化發(fā)展的大趨勢下,羊肚菌的室內(nèi)栽培技術(shù)也成為了當(dāng)下研究的重點。研究表明,目前記錄的羊肚菌大部分屬于低溫型菌類;在菌絲營養(yǎng)生長階段,需控制生產(chǎn)車間溫度在15℃~18℃,培養(yǎng)基質(zhì)含水量為70%~80%;生殖生長階段,子實體最適宜的溫度為13℃~16℃,空氣相對濕度保持在85%~95%,光照為 400 lx~500 lx,CO2濃度<0.3%[38]。根據(jù)最近報道,中國科學(xué)院昆明植物研究所珍稀食用菌研究團隊于2021年2月,成功研發(fā)出羊肚菌工廠化栽培成套新技術(shù),初步實現(xiàn)了工廠化栽培羊肚菌[56]。
從最初采食野生羊肚菌,到目前實現(xiàn)大面積人工栽培,羊肚菌產(chǎn)業(yè)雖然取得了突破性進展,但仍然有下述諸多問題,致使其長期處于供給不足的狀態(tài)。
1)目前我國僅有梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌2個主栽品種,人工栽培品種的可選擇性較少,不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求,且這2個主栽品種菌種老化、退化的現(xiàn)象明顯。
2)由于栽培用菌種和外源營養(yǎng)補給的不穩(wěn)定性,導(dǎo)致了整個產(chǎn)業(yè)發(fā)展的不穩(wěn)定。
3)缺乏系統(tǒng)、標(biāo)準的人工栽培技術(shù)規(guī)范等。
為了實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)長足發(fā)展,在進行羊肚菌的分類鑒定時,如果能將形態(tài)學(xué)分類和多基因聯(lián)合分析技術(shù)有效結(jié)合,將進一步提升羊肚菌屬物種鑒定的準確性。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合最新理論研究成果,加強育種技術(shù)的開發(fā),完善和推廣生產(chǎn)用菌種質(zhì)量評價體系,深入外源營養(yǎng)供給體系機制研究,必將有力推進羊肚菌工廠化栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。