喬 婷，李峻志，戴 璐，賀曉龍，趙瑞華，高小朋**

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

羊肚菌（Morchella spp.）是一種珍稀的食藥兼用真菌，隸屬于子囊菌門（Asomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目 （Pezizales）羊肚菌科 （Morchellaceae），其風(fēng)味獨特，富含多種活性物質(zhì)，在世界范圍內(nèi)具有很高的科學(xué)價值和經(jīng)濟價值[1]。據(jù)報道，羊肚菌的栽培是近100多年來的研究熱點，很早以前就有過關(guān)于食用野生羊肚菌的相關(guān)記錄，隨著其營養(yǎng)價值逐漸被發(fā)現(xiàn)，研究人員開始深入研究羊肚菌的生態(tài)分布特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、人工栽培技術(shù)以及食（藥）用功效等[2-3]。但是對于羊肚菌分類鑒定方法和科學(xué)的人工栽培技術(shù)研究一直都備受爭議。因此，通過對目前羊肚菌的分類鑒定方法及人工栽培技術(shù)（主要包括菌種和外源營養(yǎng)兩大難題）進行綜述，以期為羊肚菌的優(yōu)良種質(zhì)資源開發(fā)和人工栽培技術(shù)研究提供科學(xué)思路，為產(chǎn)業(yè)的良性健康發(fā)展奠定扎實的理論基礎(chǔ)。

1 羊肚菌分類鑒定方法

1.1 形態(tài)分類鑒定

早期研究主要是依據(jù)宏觀和微觀形態(tài)特征對羊肚菌屬進行分類。宏觀特征主要包括菌蓋、菌柄、子囊果的形狀、大小、顏色，菌蓋與菌柄交界處的特征，脊和凹坑的排列、形態(tài)、顏色等；微觀方面主要包括子囊的形狀、分布特征，子囊孢子和側(cè)絲的形狀、直徑、顏色，剛毛的形態(tài)、大小，菌蓋上是否有絨毛、菌柄上是否有顆粒附著物以及其形態(tài)和大小等。此外，羊肚菌不同時期菌絲的形態(tài)特征、孢子印顏色、菌核的形態(tài)、形成時間以及在培養(yǎng)基上的分布特征等，都可以輔助進行羊肚菌的形態(tài)學(xué)分類[4]。在英國真菌索引數(shù)據(jù)庫（Index Fungorum）中，羊肚菌屬記錄有350個名稱物種，去除同物異名的情況，全球可能有近150個形態(tài)學(xué)物種[5]。根據(jù)羊肚菌菌蓋顏色、棱紋走向、菌蓋凹陷深淺及形狀、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋近中部與菌柄是否分離等特征，將羊肚菌分為黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類及半開羊肚菌類共3個形態(tài)分類單元[6-9]。根據(jù)成熟時子囊果的子實層和菌柄變紅與否提出了第四個類群，即變紅羊肚菌類群[10]。最新研究證明，使用復(fù)水、脫水、臨界點干燥制備技術(shù)對羊肚菌子囊孢子進行掃描電子顯微鏡（SEM）成像，可以提高孢子壁表面的分辨率，從而增加形態(tài)學(xué)特征的數(shù)量[11]。羊肚菌表型特征往往與地理發(fā)生或生態(tài)學(xué)相輔相成，特別是與特定喬木或灌木的假定關(guān)系，有時也可以提供形態(tài)分類信息[12]。但可用于羊肚菌屬物種形態(tài)學(xué)分類的特征較少，且同一物種內(nèi)形態(tài)學(xué)特征差異較大，形狀、顏色和大小又會隨著環(huán)境、地理位置的變化發(fā)生改變，甚至在不同生長階段都存在較大差異，因此造成羊肚菌同物異名和同名異物的現(xiàn)象頻出[13-14]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分子鑒定

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分子鑒定是以DNA序列為特征，通過測定一個或者幾個標(biāo)準的目的基因，如真菌中的ITS、LSU等DNA序列，來進行物種多樣性分析以構(gòu)建正確的物種鑒定體系[4]。截止2010年，羊肚菌屬的分子系統(tǒng)標(biāo)記以核糖體DNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）為主；之后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多基因聯(lián)合分析技術(shù)形成，可通過多個基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，比較其拓撲學(xué)關(guān)系，并以此界定物種[15]，截至目前，該方法一直是羊肚菌分類研究的主要方法。

1.2.1 單基因測序

在過去很長一段時間中，ITS被用作分析環(huán)境樣本中真菌多樣性的靶標(biāo)，ITS序列分析技術(shù)廣泛用于真菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，但基因庫（Gen－Bank）中ITS數(shù)據(jù)來源廣泛，其命名的準確性直接影響基于ITS序列分析的鑒定結(jié)果[16]。此外，有學(xué)者通過研究國際序列數(shù)據(jù)庫，估計了真菌界目前可獲得的所有真菌種內(nèi)ITS變異性；在數(shù)據(jù)庫內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了巨大的差異，其結(jié)果難以將分類單元的分類隸屬關(guān)系或營養(yǎng)模式相關(guān)聯(lián)；而對于種內(nèi)變異，似乎沒有一個統(tǒng)一而嚴格的上限適用于整個真菌界，例如典型的3%閾值。因此，不應(yīng)使用簡化的方法來實現(xiàn)基于ITS的物種界定[17]。

1.2.2 多基因聯(lián)合測序

鑒于此，研究人員在ITS序列分析的基礎(chǔ)上，通過增加LSU、rpb1、rpb2和tef1多個基因的DNA序列來界定物種，使分類與鑒定結(jié)果更加科學(xué)和客觀[18]。研究結(jié)果證實，如使用單一的ITS序列鑒定羊肚菌屬物種，僅有約76%的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種可以被識別；而利用4基因進行聯(lián)合分析（ITS+tef1+rpb1+rpb2），則可以鑒定出該屬的所有物種[19-20]。在此研究基礎(chǔ)上，研究人員提出羊肚菌屬由黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和變紅羊肚菌支系 （Rufobrunnea Clade）構(gòu)成[21]，這一結(jié)論較形態(tài)學(xué)分類更加準確。隨著羊肚菌分類研究的深入，羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Morchella Multilocus Sequence Typing，Morchella MLST）[20]應(yīng)運而生，這一數(shù)據(jù)庫的建立為研究人員更加準確地鑒定羊肚菌提供了便利。截止目前，該數(shù)據(jù)庫包含了分別為ITS、LSU、rpb1、rpb2和tef1等5個片段的2 406條羊肚菌基因序列，其中羊肚菌研究專家提供了2 160條序列，另外246條序列來源于GenBank且已被證明其準確無誤。相關(guān)學(xué)者可以通過該數(shù)據(jù)庫獲得羊肚菌序列數(shù)據(jù)、相應(yīng)的物種名稱及館藏標(biāo)本或培養(yǎng)物等信息，同時也可以向該網(wǎng)站提供有關(guān)羊肚菌的可靠的DNA序列數(shù)據(jù)[22]。

2 人工栽培研究進展

2.1 人工栽培的關(guān)鍵影響因素

目前，影響羊肚菌人工栽培成功與否的因素較多，主要包括栽培品種的選擇、栽培季節(jié)的安排、制種技術(shù)、播種技術(shù)、營養(yǎng)袋技術(shù)、環(huán)境調(diào)控技術(shù)等，但菌種技術(shù)和外源營養(yǎng)補料技術(shù)仍然是影響我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展的兩項關(guān)鍵因素[23-24]。

2.1.1 菌種

菌種幾乎是所有食用菌栽培的關(guān)鍵，菌種的質(zhì)量差異直接影響著栽培的成功與否。而羊肚菌是一種生活史較為復(fù)雜的子囊菌，從初期子囊孢子萌發(fā)成菌絲體，菌絲生長后期通過緊密連接交織形成休眠體結(jié)構(gòu)“菌核”，到最終形成子囊果從而又產(chǎn)生分生孢子，其機制可能與遺傳背景、發(fā)育和環(huán)境條件等密切相關(guān)。且由于羊肚菌的菌核沒有明顯的菌核結(jié)構(gòu)特征，又被稱為“假菌核”。研究表明，羊肚菌菌核的形成情況與菌種的活力、純度、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基配方等密切相關(guān)[25-26]。最新研究檢測出只有一種交配型基因存在于羊肚菌菌核中，因此可考慮將其作為選育菌種的材料，但菌核與羊肚菌子實體的形成以及產(chǎn)量之間的關(guān)系有待進一步研究[27]。此外，羊肚菌栽培過程中會產(chǎn)生大量的分生孢子，最新研究成果表明，羊肚菌分生孢子由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生，部分分生孢子包含1個～3個核；結(jié)合相關(guān)研究成果推測，分生孢子可能通過3種途徑參與羊肚菌子實體的形成過程，極有可能是作為精子細胞提供相反的交配型基因，也可能萌發(fā)成雌雄同體的兼性菌絲體，或作為生殖繁殖體參與其生殖過程；但羊肚菌分生孢子的發(fā)生與子實體形成以及是否為栽培中必不可少的階段仍舊沒有定論[28-29]。由于目前對羊肚菌復(fù)雜的生物學(xué)基礎(chǔ)研究較少，嚴重制約了羊肚菌野生品種馴化以及新品種選育的進度。因此，目前人工栽培的羊肚菌品種仍然集中在黑色類群中，包括梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.exima）、頭絲羊肚菌（M.exuberans）、歐氏羊肚菌（M.owneri）、Mel-13和Mel-21在內(nèi)的7個系統(tǒng)發(fā)育種，其中以六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌栽培規(guī)模最大[30]。而其他品種的羊肚菌是否可以進行人工栽培尚不清楚，有待進一步研究[31]。

系統(tǒng)科學(xué)的羊肚菌菌種質(zhì)量評價體系對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必不可少，但羊肚菌菌絲體的形態(tài)特征隨著培養(yǎng)基的變化表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，這無形中提高了菌種質(zhì)量評價的難度[32-33]。因此，我國尚無明確的羊肚菌菌種質(zhì)量標(biāo)準，大部分菇農(nóng)僅根據(jù)菌核數(shù)量來判斷羊肚菌菌種質(zhì)量。最新研究表明，通過對羊肚菌菌株分類地位、交配型基因、菌株活力綜合評估，可確保菌株在人工栽培過程中表現(xiàn)出優(yōu)良、穩(wěn)定的性狀[34]。另一方面，菌種老化是羊肚菌栽培過程中的普遍現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌種老化與頻繁地傳代培養(yǎng)、不當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和保存條件、或營養(yǎng)環(huán)境不匹配相關(guān)[35]；也有研究表明羊肚菌菌種老化機制與線粒體活性相關(guān)，但對于指導(dǎo)生產(chǎn)來說還是缺乏系統(tǒng)的研究[36]。目前生產(chǎn)者對于此問題的解決辦法是反復(fù)從孢子培養(yǎng)物中重新選擇菌種，但依然難以保證菌種的穩(wěn)定性[37]?；诖?，研究人員只有通過選育多個性狀優(yōu)良、產(chǎn)量穩(wěn)定、可人工栽培的品種，同時深入研究羊肚菌菌種老化以及菌種與子實體形成之間的內(nèi)在機制，才能加快羊肚菌人工栽培技術(shù)的發(fā)展。

2.1.2 外源營養(yǎng)

外源營養(yǎng)袋技術(shù)的發(fā)展，較好地解決了羊肚菌人工栽培過程中營養(yǎng)補給這一難題，我國研究人員經(jīng)過數(shù)十年的科研和實踐，使該技術(shù)日趨成熟。但在外源營養(yǎng)袋的使用過程中，菇農(nóng)們對于營養(yǎng)袋的科學(xué)配比、制作技術(shù)、放置時間、數(shù)量以及撤袋時間等仍眾說紛紜，因此營養(yǎng)袋作用機制的研究尤為重要[24，38]。

外源營養(yǎng)袋技術(shù)是羊肚菌栽培過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有準確地掌握其制作和使用的技術(shù)要點，才能提高出菇的質(zhì)量和產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，外源營養(yǎng)袋的配比與羊肚菌的出菇周期、產(chǎn)量呈正相關(guān)性，如按照小麥58%、闊葉樹木屑30%、腐質(zhì)土10%、石膏1%、石灰1%的配比，既有利于縮短梯棱羊肚菌的出菇周期，也可以提高產(chǎn)量；放置外源營養(yǎng)袋時，采用“一”字形狀的劃口，有利于降低污染率、提高產(chǎn)量[39]。研究人員通過檢測并分析了7種常見食用菌栽培原料的化學(xué)成分，結(jié)合栽培試驗驗證，探究了羊肚菌栽培產(chǎn)量背后的營養(yǎng)袋化學(xué)成分差異效應(yīng)，為現(xiàn)有的營養(yǎng)袋配方提供了理論支撐[40]。另外，通過研究營養(yǎng)袋相關(guān)因素對羊肚菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)施放營養(yǎng)袋時間與出菇期呈正比，營養(yǎng)袋中麥粒含量與子實體產(chǎn)量也呈正比[41]。也有研究發(fā)現(xiàn)，外源營養(yǎng)袋的重量變化量和子實體產(chǎn)量成正相關(guān)；當(dāng)外源營養(yǎng)袋重量減輕＞50%，羊肚菌產(chǎn)量才可以達到正常產(chǎn)量（2 250 kg·hm-2）以上[42]。

有研究通過使用放射性標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在羊肚菌營養(yǎng)生長過程中，從營養(yǎng)豐富到營養(yǎng)貧乏環(huán)境的改變，可以誘導(dǎo)真菌進入生殖生長周期，在此周期中形成子囊果[43-46]。為了研究羊肚菌的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運機制，Amir等[47]用細胞壓力探針測定了分割平板培養(yǎng)羊肚菌時菌絲和菌核中膨壓的變化；對于包括羊肚菌在內(nèi)的形成菌核的真菌，菌絲的生長、菌核的形成和發(fā)育過程中，存在著菌絲和菌核的變化以及兩者之間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運；影響物質(zhì)轉(zhuǎn)運的因素包括培養(yǎng)基的水勢梯度和菌絲、菌核的代謝活性及其膨壓差[48]。為了研究羊肚菌的分解及營養(yǎng)運輸機制，研究人員對一株可人工栽培的羊肚菌進行了基因組測序，并鑒定了營養(yǎng)袋分解裝置的編碼基因；然后用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)，分析編碼后碳水化合物活性酶（CAZymes）的表達情況；結(jié)果表明，羊肚菌營養(yǎng)菌絲體定植于外源營養(yǎng)袋上，釋放出一系列降解酶，有效分解和代謝多糖，如小麥和稻殼中的淀粉和纖維素；經(jīng)此分解機制釋放的代謝產(chǎn)物運輸?shù)骄哺浇耐寥辣韺樱M而誘發(fā)子實體形成；該發(fā)現(xiàn)有助于更詳細地描述誘發(fā)羊肚菌子實體形成的分子機制[49]。

2.2 栽培模式

2.2.1 大田栽培模式

隨著羊肚菌人工栽培技術(shù)的日益成熟，我國在田間和林下栽培羊肚菌的規(guī)模迅速擴大。其中大田栽培主要包括田地的選擇與整理、菌種制備、播種、補料技術(shù)、保育催菇、出菇管理和采收干制等主要環(huán)節(jié)。為了降低生產(chǎn)成本，合理利用林木資源和土地空間，學(xué)者和菇農(nóng)也嘗試通過模擬自然環(huán)境林下栽培羊肚菌，并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌林下設(shè)施栽培中，在栽培床上方采取“搭建小弓棚+覆蓋薄膜”的方式，比單純覆蓋遮陽網(wǎng)的方式產(chǎn)量更高[50]。

2.2.2 設(shè)施化栽培模式

由于羊肚菌大田露天栽培易受氣候和土壤的強烈影響，風(fēng)險較大；如2021年氣候反常，全國冬季平均氣溫集中在4℃～12℃，導(dǎo)致多地出菇過早，羊肚菌的營養(yǎng)生長還未達到生理成熟，同時由于溫差變化較大，發(fā)生大面積死菇，給羊肚菌栽培者造成巨大損失[51]。隨著產(chǎn)業(yè)大規(guī)模發(fā)展，為了減少自然氣候條件對羊肚菌栽培造成的影響，近幾年越來越多的從業(yè)者開始摸索適宜當(dāng)?shù)貧夂驐l件的設(shè)施化栽培模式。所謂設(shè)施化栽培，主要是通過機械設(shè)備干預(yù)，采用工程技術(shù)手段，創(chuàng)建適宜羊肚菌生長的氣候條件。根據(jù)地域差異，目前羊肚菌設(shè)施栽培主要以“南方冷棚、北方暖棚”2種模式為代表[52]。

1）南方冷棚

南方地區(qū)的冷棚以簡易的塑料大棚為代表，用鍍鋅鋼架為主要材料，棚頂覆蓋塑料薄膜。冷棚搭建成本低、速度快、使用方便[53]。但冷棚栽培羊肚菌的周期較長，一般需要經(jīng)過5個月～6個月的管理，才可以出菇。

2）北方暖棚

為了抵御惡劣氣候環(huán)境的影響，北方暖棚多為半拱形，呈坐北朝南建設(shè)[54]。暖棚羊肚菌栽培一般從11月上旬開始播種，經(jīng)過菌絲著床萌發(fā)、地表菌霜形成、菌霜消失，共計需要50 d～60 d，次年元旦前后進行出菇管理，栽培周期相對較短[55]。

2.2.3 工廠化栽培

雖然以上2種模式從某種程度上可以保證羊肚菌人工栽培的成功率，但無法實現(xiàn)羊肚菌的周年化栽培，因此研究人員在室內(nèi)工廠化栽培方面不斷地探索，并取得一定成效。

美國Garry Mill早在1982年就進行了羊肚菌工廠化栽培的研究，并于2005年獲得成功，使整個栽培周期只需要70 d[38]，這是世界上迄今為止唯一實現(xiàn)羊肚菌工廠化栽培的典型。而在我國食用菌產(chǎn)業(yè)快速工業(yè)化發(fā)展的大趨勢下，羊肚菌的室內(nèi)栽培技術(shù)也成為了當(dāng)下研究的重點。研究表明，目前記錄的羊肚菌大部分屬于低溫型菌類；在菌絲營養(yǎng)生長階段，需控制生產(chǎn)車間溫度在15℃～18℃，培養(yǎng)基質(zhì)含水量為70%～80%；生殖生長階段，子實體最適宜的溫度為13℃～16℃，空氣相對濕度保持在85%～95%，光照為 400 lx～500 lx，CO2濃度＜0.3%[38]。根據(jù)最近報道，中國科學(xué)院昆明植物研究所珍稀食用菌研究團隊于2021年2月，成功研發(fā)出羊肚菌工廠化栽培成套新技術(shù)，初步實現(xiàn)了工廠化栽培羊肚菌[56]。

3 展望

從最初采食野生羊肚菌，到目前實現(xiàn)大面積人工栽培，羊肚菌產(chǎn)業(yè)雖然取得了突破性進展，但仍然有下述諸多問題，致使其長期處于供給不足的狀態(tài)。

1）目前我國僅有梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌2個主栽品種，人工栽培品種的可選擇性較少，不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，且這2個主栽品種菌種老化、退化的現(xiàn)象明顯。

2）由于栽培用菌種和外源營養(yǎng)補給的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致了整個產(chǎn)業(yè)發(fā)展的不穩(wěn)定。

3）缺乏系統(tǒng)、標(biāo)準的人工栽培技術(shù)規(guī)范等。

為了實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)長足發(fā)展，在進行羊肚菌的分類鑒定時，如果能將形態(tài)學(xué)分類和多基因聯(lián)合分析技術(shù)有效結(jié)合，將進一步提升羊肚菌屬物種鑒定的準確性。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合最新理論研究成果，加強育種技術(shù)的開發(fā)，完善和推廣生產(chǎn)用菌種質(zhì)量評價體系，深入外源營養(yǎng)供給體系機制研究，必將有力推進羊肚菌工廠化栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。