王亞妮，李莉萍，張陽(yáng)，張敏莉

(寶雞市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西寶雞721013)

0 前言

再生蛋白質(zhì)纖維是區(qū)分于蠶絲、羊毛等天然蛋白質(zhì)纖維，利用高科技方法制造出的富含蛋白質(zhì)的纖維。一般情況下，先由含有蛋白質(zhì)的動(dòng)植物中提煉出蛋白質(zhì)溶液，然后將其與其他高聚物共同接枝或共混復(fù)合而成[1]。國(guó)外研究可追溯到19世紀(jì)60年代，而在我國(guó)，上世紀(jì)末才開始對(duì)其進(jìn)行研究及開發(fā)利用。目前，再生蛋白質(zhì)纖維品種繁多，比如大豆蛋白纖維、牛奶蛋白纖維、蠶蛹蛋白纖維和玉蠶蛋白纖維等，其中大部分都已經(jīng)規(guī)模化生產(chǎn)，普遍應(yīng)用于日常生活中。由于其富含蛋白質(zhì)而深受消費(fèi)者的青睞，蛋白質(zhì)的優(yōu)良特性也使得蛋白質(zhì)含量成為蛋白質(zhì)纖維性能的重要指標(biāo)。然而，目前此類產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)方法研究甚少，標(biāo)準(zhǔn)體系還不健全，消費(fèi)者無(wú)法很好地了解產(chǎn)品性能，維護(hù)自身權(quán)益。因此，研究更優(yōu)化、更準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是目前迫切需要解決的課題。

本文把分光光度法應(yīng)用于再生蛋白質(zhì)纖維的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的探索，影響因素的分析，數(shù)據(jù)的對(duì)比，形成更優(yōu)化、更易于推廣的再生蛋白質(zhì)纖維中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的試驗(yàn)方法。

1 方法原理

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，再生蛋白質(zhì)纖維中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸生成硫酸銨，在pH為4.8的乙酸鈉和乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3，5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長(zhǎng)400 nm的環(huán)境下測(cè)定其吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為所含蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 試驗(yàn)部分

2.1 樣品

試驗(yàn)樣品有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的羊毛及蠶絲，牛奶蛋白纖維（乙烯醇基）、牛奶蛋白纖維（丙烯腈基）、大豆蛋白纖維（乙烯醇基）和蠶蛹蛋白纖維（黏膠基）。

2.2 主要試劑

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉（質(zhì)量濃度300 g/L）、對(duì)硝基苯酚指示劑溶液、乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的甲醛、乙酰丙酮（以上均為分析純）。

2.3 儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)、石墨消化儀、恒溫水浴鍋（100±0.5）℃、天平、10 mL具塞玻璃比色管、容量瓶（100 mL、50 mL）、刻度吸管。

2.4 測(cè)試

2.4.1 樣品前處理和消化

樣品的前處理依據(jù)GB/T 2910.1—2009《紡織品定量化學(xué)分析第1部分：試驗(yàn)通則》中8.2規(guī)定的方法進(jìn)行。稱取一定量處理過(guò)的混勻的試樣（精確至0.001 g）于消化管中，加入一定量的硫酸銅、硫酸鉀和硫酸，在石墨消化儀中進(jìn)行消化處理一段時(shí)間，直至液體呈藍(lán)綠色透明狀，再加熱一段時(shí)間，取下冷卻，慢慢加入少量的水，放冷后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，在此消化過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以及樣品測(cè)定

吸取5.0 mL試樣及試劑空白消化液于50 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入1～2滴對(duì)硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無(wú)色，用水稀釋至刻度，混勻、備用。然后繪制氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)吸取2.0 mL上述試樣溶液和同量的試劑空白溶液于10 mL比色管中，加乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及顯色劑，混勻，置于沸水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。

2.4.3 計(jì)算公式

含量測(cè)定的計(jì)算公式見式1。

式中：w——試樣中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

m1——試樣測(cè)定液中氮的質(zhì)量，μg；

m0——試劑空白測(cè)定液中氮的質(zhì)量，μg；

m——試樣質(zhì)量，g；

100——換算系數(shù)；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

2.5 比對(duì)方法

2.5.1 次氯酸鈉法

2.5.2 凱氏定氮法

凱氏定氮法是經(jīng)典的檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的成熟方法，其起初是檢測(cè)乳制品、食品類產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量最常用方法之一，后被應(yīng)用到其他檢測(cè)領(lǐng)域。凱氏定氮法試驗(yàn)依據(jù)FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質(zhì)含量試驗(yàn)方法》中方法A來(lái)測(cè)試樣品中蛋白質(zhì)含量，差異在于其使用全自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測(cè)試。所用儀器為Kjeltec 8200型福斯自動(dòng)凱氏定氮儀。

3 結(jié)果與討論

3.1 分光光度法測(cè)試影響因素

3.1.1 樣品

再生蛋白纖維由于其特殊的成絲原理，一般選擇一種基體作為依托，融合蛋白質(zhì)液來(lái)紡絲，最終呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)和基體材料兩種特性。目前成絲所用的基體大多為黏膠、聚乙烯醇和聚丙烯腈等高聚物。比如，黏膠基的蠶蛹蛋白黏膠纖維、聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維等。而按照分光光度法試驗(yàn)原理，此方法會(huì)檢出樣品中所有的含氮原子，對(duì)于聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維，此方法檢出的蛋白質(zhì)含量還包含了聚丙烯腈里的氮原子，最終會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量檢出值偏高。牛奶蛋白纖維含量測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 牛奶蛋白纖維測(cè)試結(jié)果

表1中的牛奶蛋白纖維為兩種：一種是聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維；另一種是乙烯醇基的牛奶蛋白纖維。前一種為質(zhì)量百分比為30%的牛奶蛋白纖維和70%棉纖維的混合物，后一種為純牛奶蛋白纖維，用3種不同的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)于丙烯腈基的牛奶蛋白纖維，用分光光度計(jì)法和凱氏定氮法檢出的蛋白質(zhì)含量偏高；對(duì)于乙烯醇基的牛奶蛋白纖維，3種方法檢測(cè)結(jié)果則無(wú)明顯差異。因此，在蛋白質(zhì)含量檢測(cè)時(shí)，了解樣品的結(jié)構(gòu)以及特性是首要任務(wù)，是選擇合適正確方法的前提。

3.1.2 消化時(shí)間與消化溫度

本試驗(yàn)中，選擇用石墨消化儀來(lái)消化試樣，既批量化又安全且節(jié)約時(shí)間，但合適的消化溫度和準(zhǔn)確的消化時(shí)間是關(guān)鍵因素。依據(jù)硫酸的沸點(diǎn)，試驗(yàn)中起初選擇消化溫度為400℃，消化時(shí)間1 h時(shí)，觀察消化液成淺黃色，消化不完全；消化溫度不變，延長(zhǎng)消化時(shí)間，不斷觀察直至?xí)r間為2 h時(shí)，消化液成藍(lán)綠色并且澄清透明，消化完全。但消化液放涼后，發(fā)現(xiàn)存在消化液結(jié)塊現(xiàn)象，且同一樣品測(cè)定結(jié)果值差異較大。調(diào)整消化溫度為420℃，隨著消化時(shí)間增加，觀察消化液變化，直至消化時(shí)間為1.5 h時(shí)，消化液成藍(lán)綠色且澄清透明，消化完全，且放涼之后消化液整體呈溶液狀態(tài)，同一樣品測(cè)定結(jié)果值也較穩(wěn)定。

循環(huán)互改法是以寫作小組內(nèi)部相互評(píng)價(jià)作文為主的，批語(yǔ)評(píng)價(jià)后反饋給作者的一種作文評(píng)改方式。循環(huán)互改法的實(shí)施流程一般為：

3.1.3 水浴加熱溫度

試驗(yàn)中水浴加熱時(shí)間為15 min的過(guò)程中，水浴的溫度對(duì)試驗(yàn)成功與否起決定性作用。當(dāng)水浴鍋的溫度不能持續(xù)保持在沸騰狀態(tài)時(shí)，15 min之后拿出比色管放涼，比色管里的溶液較渾濁，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，同一樣品整體數(shù)值偏高，精密度結(jié)果偏差大。但是，當(dāng)水浴鍋溫度持續(xù)保持在沸騰狀態(tài)時(shí)，加熱15 min之后的比色管里溶液澄清透明，同一樣品的數(shù)值穩(wěn)定，精密度結(jié)果良好。所以在試驗(yàn)中，為了確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一定要控制好水浴溫度，必須保持在持續(xù)沸騰的狀態(tài)。

3.1.4 氮換算為蛋白質(zhì)系數(shù)

氮元素在所有蛋白質(zhì)中含量較為穩(wěn)定，約占16%[2]，分光光度法就是利用蛋白質(zhì)中氮元素的含量來(lái)測(cè)蛋白質(zhì)含量。所以在2.4.3中的計(jì)算公式（1）中，要乘以F（氮換算為蛋白質(zhì)系數(shù)）值計(jì)算出最終的蛋白質(zhì)含量。而氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)雖是一個(gè)常數(shù)，但在不同的物質(zhì)中有所差異，比如在大豆蛋白制品中一般為6.25，在純?nèi)榕c乳制品中為6.38，這些數(shù)值參考食品標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)的折算系數(shù)，對(duì)于再生蛋白纖維中蛋白質(zhì)含量的折算是否準(zhǔn)確不得而知。本文依據(jù)FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質(zhì)含量試驗(yàn)方法》中的規(guī)定，再生蛋白質(zhì)纖維氮換算系數(shù)為6.25。但對(duì)于羊毛、蠶絲等蛋白質(zhì)纖維，沒有準(zhǔn)確可參考的數(shù)值，本試驗(yàn)則是通過(guò)次氯酸鈉法比較試驗(yàn)分析，最終得出羊毛氮換算系數(shù)為5.79、蠶絲氮換算系數(shù)為5.55。

3.2 三種方法的測(cè)試結(jié)果以及數(shù)據(jù)分析

用分光光度、凱氏定氮和次氯酸鈉分別測(cè)試羊毛、蠶絲、牛奶蛋白纖維（乙烯醇基）、大豆蛋白纖維和牛奶蛋白纖維中的蛋白質(zhì)含量，測(cè)試結(jié)果見表2、表3和表4。

表2 分光光度法測(cè)試結(jié)果

表3 凱氏定氮法測(cè)試結(jié)果

表4 次氯酸鈉法測(cè)試結(jié)果

依據(jù)FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質(zhì)含量試驗(yàn)方法》中的精密度的規(guī)定（在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)值不得超過(guò)算數(shù)平均值的10%，以大于算數(shù)平均值10%的情況不超過(guò)5%為前提），分析數(shù)據(jù)的精密度，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。同時(shí)，計(jì)算各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢測(cè)結(jié)果的精密度良好。

3.3 與次氯酸鈉法、凱氏定氮法比較

為了判定3種方法之間的差異性，采用F檢驗(yàn)法單因素方差分析對(duì)3種方法的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 分光光度法、次氯酸鈉法和凱氏定氮法的比較

由表5可見，在置信區(qū)間95%下，計(jì)算出同一樣品3種不同方法的P值＞0.05，這說(shuō)明3種方法測(cè)試的數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。

4 結(jié)語(yǔ)

（1）分光光度法測(cè)試再生蛋白質(zhì)纖維中蛋白質(zhì)含量的原理實(shí)為全氮法，即檢出樣品中所有含氮元素的量。所以它同凱氏定氮法一樣存在局限性，不適合再生蛋白質(zhì)纖維基體中含有氮元素的纖維，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果偏高。

（2）分光光度法試驗(yàn)時(shí)，完全消化條件為消化溫度420℃、消化時(shí)間1.5 h，試驗(yàn)中水浴溫度持續(xù)保持在沸騰狀態(tài)，加熱15 min。

（3）分光光度法較之次氯酸鈉法，影響測(cè)試結(jié)果的因素較少，抗干擾性小，結(jié)果較準(zhǔn)確。次氯酸鈉法受次氯酸鈉濃度、溶解溫度和溶解時(shí)間等條件的影響較大。

（4）與凱氏定氮法相比較，分光光度法試劑用量少，操作簡(jiǎn)單、安全環(huán)保。同時(shí)，分光光度計(jì)是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室最基本的檢測(cè)儀器，操作簡(jiǎn)單，對(duì)人員要求不高，此方法更適合大范圍推廣。