樊秀雙（天津市東麗醫(yī)院病理科，天津 300300）

結(jié)直腸癌早期缺乏典型性表現(xiàn)，確診時(shí)多數(shù)患者病情已進(jìn)入晚期階段，5 年生存率不足10%，是我國癌癥死亡的第二大原因［1-2］。結(jié)直腸癌主要存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、染色體不穩(wěn)定性、表觀遺傳不穩(wěn)定性，其中MSI 與DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白基因缺陷密切相關(guān)，可能參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展［3-4］。目前已知錯(cuò)配修復(fù)蛋白有9 種，其中PMS2、MLH1、MSH6、MSH2為目前臨床研究熱點(diǎn)。本研究選取2018年1月至2022 年1 月我院收治的的330 例結(jié)直腸癌患者的病理標(biāo)本，分析4 項(xiàng)錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義，旨在為臨床后續(xù)診治提供科學(xué)依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月至2022 年1 月我院收治的330 例結(jié)直腸癌患者的病理標(biāo)本，其中男204 例、女126 例；年齡29~78（52.64±2.16）歲；腫瘤位置：右半結(jié)腸93例、左半結(jié)腸111例、直腸126例：腫瘤大?。骸? cm 78 例，<5 cm 252 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有144例、無186例；分化程度：高中分化110例、低分化220例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合結(jié)直腸癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，經(jīng)手術(shù)病理或結(jié)腸鏡活檢證實(shí)；（2）患者簽署知情同意書；（3）認(rèn)知功能正常；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）林奇綜合征；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）精神疾患。

1.3 方法

1.3.1 試劑與儀器 福建邁新生物技術(shù)有限公司的免疫組化SP 法檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色劑；鼠單抗MLH1、兔單抗MSH6、鼠單抗 MSH2、兔單抗PMS2均購自福州邁新公司；上海博迅電熱鼓風(fēng)干燥箱；RM2235切片機(jī)德國LEICA；珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司的Thermo 離心機(jī)；北京中杉金橋生物公司提供的PBS緩沖液；日本Olympus公司的顯微鏡。

1.3.2 標(biāo)本處理 所有標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋后，將其切片，厚度為4 μm，用65℃烤片2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脫蠟10 min，分別用95%乙醇、100%乙醇、75%乙醇、85%乙醇的酒精實(shí)施5 min 的脫二甲苯，分別使用自來水、蒸餾水沖洗，將酒精脫去。完成后PBS緩沖液沖洗切片3次，每次30 min。在高壓鍋內(nèi)加入1 000 ml EDTA 抗原修復(fù)液（pH 為8.0），加熱至沸騰。脫蠟至水后，切片架上擺放切，置于高壓鍋內(nèi)，確保液面沒過石蠟切片，將鍋蓋蓋好，避免燙傷。待高壓鍋噴汽后計(jì)時(shí)2.5 min，冷水內(nèi)放置高壓鍋，降至室溫后取出切片。PBS 緩沖液連續(xù)沖洗3 次修復(fù)后的切片，5 min/次。用3%過氧化氫封閉10 min，將內(nèi)源性過氧化酶消除，PBS 緩沖液連續(xù)沖洗3 次，5 min/次。取出切片，保持組織濕潤基礎(chǔ)上，盡量將組織周邊的緩沖液擦干，濕盒內(nèi)滴加一抗至完全覆蓋組織，放置在4℃冰箱內(nèi)過夜。取出切片，室溫下放置至恢復(fù)室溫，用PBS 緩沖液連續(xù)沖洗3 次，5 min/次。組織周邊的緩沖液擦拭后，將二抗（EDTA）滴加于組織表面至完全覆蓋組織。PBS緩沖液連續(xù)沖洗3次，5 min/次，切片取出，將DAB顯色劑滴加于其表面，放置5 min，隨后置于水內(nèi)終止顯色，用自來水沖漂洗3 min。蘇木素復(fù)染1 min 的，沖洗（流水），放置在鹽酸酒精分化液中5 min，清水中沖洗。用95%乙醇I、95%乙醇II、100%乙醇I各脫水1 min，取出切片，風(fēng)干，在鏡下進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 均定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核不著色為缺失，陽性細(xì)胞呈棕黃色或黃色顆粒。每張切片在高倍顯微鏡（400 倍）下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。陰性：陽性細(xì)胞率為0，1 分：<10%：2 分：11%~50%；3 分：51%~80%，4分：>80%。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，深棕色為3分。陽性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相乘評(píng)分≥2 分表示為陽性表達(dá)。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6任意一項(xiàng)缺失評(píng)定為MSI。

1.5 臨床觀察指標(biāo) 分析4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征（性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤大小、年齡等）的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（百分率）表示，行χ2檢驗(yàn)。P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況分析 330 份結(jié)直腸癌標(biāo)本中、MSH6 缺失率30 例（9.09%）、MLH1 缺失15 例（4.55%）、PMS2 缺失9 例（2.73%）MSH2缺失9例（2.73%），MSI率為20.00%（66/330）。4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)。見圖1~8。

圖1 結(jié)直腸癌組織中MLH1陽性表達(dá)（IHC×400）

圖2 結(jié)直腸癌組織中MLH1陰性表達(dá)（IHC×400）

圖3 結(jié)直腸癌組織中PMS2陽性表達(dá)（IHC×400）

圖4 結(jié)直腸癌組織中PMS2陰性表達(dá)（IHC×400）

圖5 結(jié)直腸癌組織中MSH2陽性表達(dá)（IHC×400）

圖6 結(jié)直腸癌組織中MSH2陰性表達(dá)（IHC×400）

圖7 結(jié)直腸癌組織中MSH6陽性表達(dá)（IHC×400）

圖8 結(jié)直腸癌組織中MSH6陰性表達(dá)（IHC×400）

2.2 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系分析 MLH1 缺失率與結(jié)直腸癌患者發(fā)病位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)（P<0.05），PMS2、MSH6缺失率與結(jié)直腸癌患者發(fā)病位置、分化程度有關(guān)（P<0.05），MSH2缺失率與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。見表1。

表1 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系分析[n(%)]

3 討論

正常情況下人體內(nèi)存在一條完整的由錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因編碼的DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)能夠避免細(xì)胞復(fù)制出現(xiàn)異常，對(duì)DNA 復(fù)制過程中發(fā)生錯(cuò)配堿基進(jìn)行識(shí)別，并實(shí)施水解，修復(fù)DNA 復(fù)制過程中發(fā)生的異常情況，具有維持遺傳的完整性、穩(wěn)定性以及增強(qiáng)物質(zhì)的真實(shí)性等特點(diǎn)，可起到遺傳物質(zhì)保真之效［6-8］。另外，錯(cuò)配修復(fù)蛋白可糾正DNA復(fù)制過程中長(zhǎng)的不匹配核苷酸和微衛(wèi)星中移碼突變，其表達(dá)異常可引起原癌基因、腫瘤抑制基因或DNA 修復(fù)基因突變，促使正常結(jié)腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤發(fā)生［9-10］。當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)蛋白發(fā)生甲基化或缺失、突變時(shí)，可造成簡(jiǎn)單重復(fù)序列丟失或增多，促使細(xì)胞癌變或突變［11-12］。故，早期對(duì)錯(cuò)配修復(fù)蛋白篩查，評(píng)估患者病情，有助于預(yù)防癌變。

本研究中，330 份結(jié)直腸癌標(biāo)本中MLH1 缺失15例（4.55%）、PMS2缺失9例（2.73%）、MSH2缺失9例（2.73%）、MSH6 缺失率30 例（9.09%），MSI 率為20.00%（66/330）；MLH1 缺失率與結(jié)直腸癌患者發(fā)病位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)（P<0.05），PMS2、MSH6缺失率與結(jié)直腸癌患者發(fā)病位置、分化程度有關(guān)，MSH2 缺失率與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示結(jié)直腸癌中有較高的錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失率，其與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，可作為臨床診治結(jié)直腸癌的重要指標(biāo)。MLH1、PMS2、MSH6 缺失均與發(fā)病位置有關(guān)，且多見于右半結(jié)腸，可能與生理功能、胚胎起源和血管供應(yīng)等各種生物學(xué)和臨床差異有關(guān)。右側(cè)結(jié)直腸早期不易出現(xiàn)癥狀，隨著腫瘤快速增長(zhǎng)至引起全身癥狀和腹部腫塊，此時(shí)總量大小更大且分析相對(duì)較晚，而左半結(jié)腸癌早期易出現(xiàn)消化道局部癥狀，患者易發(fā)現(xiàn)而及時(shí)就診，分析較早。MSI 屬于DNA 序列，由不等核苷酸串聯(lián)重復(fù)形成，具有高度遺傳穩(wěn)定性，產(chǎn)生MSI 原因是重復(fù)拷貝數(shù)發(fā)生較大變化，促使重要基因如PMS2、MLH1 等發(fā)生功能改變，致使MS 發(fā)生滑脫，使基因組的不穩(wěn)定性明顯增加，細(xì)胞自發(fā)突變頻率明顯提高，促使細(xì)胞增生和分發(fā)異常，降低遺傳穩(wěn)定性和導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［13-14］。MLH1、MSH2 蛋白是二聚體中的主導(dǎo)蛋白，可能與同源性錯(cuò)配修復(fù)蛋白形成二聚體發(fā)揮作用，兩者突變可降解二聚體蛋白，造成主導(dǎo)蛋白與配對(duì)蛋白表達(dá)缺失。MLH1 啟動(dòng)子高甲基環(huán)或MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 基因突變均可引起錯(cuò)配修復(fù)蛋白失活，發(fā)揮錯(cuò)配修復(fù)作用，可造成微衛(wèi)星DNA 極度不穩(wěn)定性，甚至發(fā)生出轉(zhuǎn)錄、復(fù)制錯(cuò)誤和正常細(xì)胞增殖、分化異常，為腫瘤發(fā)生、進(jìn)展提供基礎(chǔ)［15］。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者易出現(xiàn)MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白缺失和MSI率，各蛋白缺失與腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有一定關(guān)系，可作為臨床判斷患者病情的重要指標(biāo)。