閆 潔，余真妍，楊洪賓，紀帥帥，霍 強，程 秀

(蚌埠醫(yī)學院藥學院，安徽 蚌埠 233030)

載體可以顯著改善藥物降解，高效地將藥物傳遞到靶細胞提高疾病治愈率，相比于傳統(tǒng)藥物的遞送納米載體效果更佳。其中，納米載體是一種納米級微觀范疇的藥物控釋體系，能夠穿透生物屏障、提高生物相容性和延長循環(huán)時間，并通過保護藥物、靶向輸送來改善藥物的傳遞。納米載體進入細胞后，經(jīng)膜泡包被于內(nèi)體中并傳遞進入溶酶體，最后經(jīng)溶酶體逃逸成功釋放到細胞質(zhì)中。在逃逸過程，納米載體保護其負載的藥物避免被溶酶體內(nèi)的酸性水解酶降解[1]，這一關鍵步驟是納米顆粒在細胞內(nèi)輸送治療性藥物的限速步驟。隨著載體材料的設計，我們必須了解納米藥物在細胞中的行為并克服這一障礙。因此全面認識納米載體逃逸溶酶體的機制，對于提高納米載體的轉運效率具有重要的指導意義。

溶酶體膜孔洞是通過膜張力和線張力的作用形成。當膜張力大于線張力時形成孔洞，線張力大于膜張力時孔洞關閉，如多肽類細菌外毒素在pH為7時呈無規(guī)則線圈結構[2]。隨著pH的下降，多肽中質(zhì)子化的氨基酸與溶酶體膜有較高的親和性，導致線張力減少而形成孔洞并保持孔洞的穩(wěn)定[3]。溶酶體膜孔隙形成固有地限制了分子大小，使藥物的釋放受到孔隙的限制，但實現(xiàn)了由細菌外毒素介導的溶酶體逃逸。

1 溶酶體逃逸機制

1.1 質(zhì)子海綿效應“質(zhì)子海綿效應”是納米載體藥物進入溶酶體后，會吸收大量H+，導致跨膜電壓不同，從而使膜上質(zhì)子泵持續(xù)開啟。為達到電荷平衡，細胞質(zhì)中的無機離子如氯離子內(nèi)流，質(zhì)子積累與氯離子的流入相耦合，隨著離子濃度的增加溶酶體內(nèi)滲透壓大于細胞質(zhì)中滲透壓[4]。為維持滲透壓，細胞質(zhì)中的水內(nèi)流入溶酶體，水的流入及聚合物的溶脹使溶酶體破裂，破裂的內(nèi)容物被釋放到細胞質(zhì)中[5]，從而促進藥物的保護與釋放。其中，具有強緩沖能力的，能大量吸收質(zhì)子的載體材料起主要作用。因此，具有質(zhì)子海綿效應的納米載體可以促進負載的藥物進行溶酶體逃逸，成為誘導溶酶體逃逸的常用策略。

1.2 溶酶體膜的融合納米藥物可以通過與膜融合誘導逃出溶酶體，將藥物運輸?shù)郊毎|(zhì)。膜融合材料在中性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下可與溶酶體膜融合。將膜融合材料結合到納米藥物載體中，溶酶體細胞質(zhì)側的陰離子脂質(zhì)重新排列，與納米載體的陽離子脂質(zhì)形成中性離子對，使膜不穩(wěn)定，幫助藥物逃離溶酶體，實現(xiàn)藥物的釋放[6]。

1.3 光化學內(nèi)化光化學內(nèi)化(photochemical internalization，PCI)是光敏劑分子經(jīng)特定波長的光照射后發(fā)生光化學反應，將光能轉化為分子內(nèi)能，繼而在有氧條件下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)使溶酶體中的物質(zhì)避免降解并釋放到細胞質(zhì)中。溶酶體的PCI是將合適的光敏劑滯留在靶向細胞的內(nèi)吞囊泡中與治療劑配合使用，被光激活后光敏劑產(chǎn)生的ROS能誘發(fā)細胞器的選擇性損傷和破壞內(nèi)吞囊泡膜，觸發(fā)治療劑的溶酶體逃逸從而釋放內(nèi)吞藥物[7]。這允許被包裹的分子逃脫并到達細胞內(nèi)，同時細胞本身的生存能力未受到影響。

2 合成逃逸溶酶體的納米載體藥物

為了實現(xiàn)納米載體藥物逃逸溶酶體，研究者們根據(jù)上述不同的溶酶體逃逸機制，構建了多肽、毒素、脂質(zhì)、聚合物和光敏劑集成的納米載體，這些納米載體的構建對臨床實踐具有重要的借鑒意義。

2.1 多肽(穿膜肽)以pH敏感性肽[8]或富含精氨酸的細胞穿透肽、GALA肽(glutamic-alanine-leucine-alanine acid，GALA)[9-10]修飾的脂質(zhì)體是藥物輸送領域最常見的工具。這些肽誘導脂質(zhì)雙層膜重新調(diào)節(jié)成多層，使膜不穩(wěn)定，導致膜融合和孔隙的形成，協(xié)助納米顆粒內(nèi)體逃逸促進藥物釋放。最近陽離子寡肽作為非病毒基因遞送載體引起了廣泛的關注，但是其低轉染效率限制了其進一步的應用。Wang[11]等通過使用八-D-精氨酸和四-L-組氨酸形成二硫鍵交聯(lián)的嵌合多肽，創(chuàng)建了一個高效基因載體，使用該載體遞送治療性基因腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，以查看該基因是否可以轉移，并在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤作用。結果表明，新設計的含有多肽的載體能夠有效地將DNA濃縮成納米復合體，實現(xiàn)跨膜轉運，促進其內(nèi)體逃逸。

2.2 毒素毒素是從生物體中分離出來的劇毒物質(zhì)，在過去幾年里已經(jīng)證明這些毒素能通過形成孔或與膜融合克服內(nèi)體逃逸障礙來促進基因表達。并且一些毒素能與納米顆粒結合以促進納米藥物的傳遞[12]。如單核增生細胞李斯特菌能夠分泌一種李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)毒素，在感染時逃離真核溶酶體系統(tǒng)，使其能夠在宿主細胞內(nèi)安全生長和增殖[13]。將李斯特菌溶血素O對脂質(zhì)體修飾后增強了內(nèi)容物從溶酶體到細胞質(zhì)的釋放[14]。Plaza-Ga[15]等提出了利用純化的His-LLO H311A突變體蛋白及其在納米顆粒表面的結合來促進40 nm納米顆粒在小鼠胚胎成纖維細胞中的溶酶體逃逸。用腈基乙酸對納米顆粒進行特異性功能化后，實現(xiàn)了LLO的表面固定化，使組氨酸標記的蛋白質(zhì)能夠特異性結合。由于內(nèi)體的酸化使LLO蛋白從納米顆粒表面釋放，并自組裝到能穿透內(nèi)體/溶酶體膜的孔中，最終納米顆粒得以逃逸。

2.3 脂質(zhì)脂質(zhì)通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化到細胞中并降解成脂質(zhì)體，脂質(zhì)體作為非病毒遞送系統(tǒng)的主要載體之一，也是目前研究最廣泛的將治療藥物遞送到細胞內(nèi)的納米技術工具。然而，納米顆粒的溶酶體逃逸成為開發(fā)這項技術的主要障礙[16]。因此需要開發(fā)出利用脂質(zhì)等載體使納米顆粒從內(nèi)體逃逸到胞質(zhì)的高效藥物傳遞。環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cyclic arginine-glycine-aspartic acid，cRGD)肽被廣泛地用作腫瘤靶向配體。Wang[17]等將DSPE-PEG2000-cRGD的后插入策略應用于由雙子樣陽離子脂質(zhì)(cationic lipid，CLD)和中性胞嘧啶包裹的3',3"-雙肽-siRNA(pp-siRNA)納米粒子。結果表明PP-siRNA/CLD/DNCA/DSPE-PEG2000-cRGD(PCNR)的納米顆粒能夠特異性靶向整合素αvβ3高表達的腫瘤細胞。此外與pp-siRNA/CLD/DNCA/cRAD(PCNA)的非靶向納米復合物相比，它可以有效下調(diào)相關蛋白水平、抑制A375細胞的細胞增殖。PCNR的攝取途徑主要取決于細胞中的內(nèi)吞和巨胞飲作用，它們可以繞過溶酶體或迅速導致溶酶體逸出以減少siRNA降解。表明脂質(zhì)納米載體增加了siRNA的遞送并提高了轉染效率。Qiao[18]等采用基于RNAi的免疫調(diào)節(jié)來改變腫瘤的免疫微環(huán)境的阻礙并提高化療效果。此次研究建立了具有雙重靶向性和ROS響應的納米治療系統(tǒng)Angiopep LipoPCB(Temozolomide+BAP/siTGF-β)，ALBTA遞送替莫唑胺用于顱內(nèi)成膠質(zhì)細胞瘤治療。本研究中的納米顆粒展現(xiàn)出了良好的載藥率和穩(wěn)定性，可以有效地穿透血腦屏障，并通過受體介導的胞吞作用靶向膠質(zhì)母細胞瘤細胞保護siRNA不被降解。ALBTA中的兩性離子脂質(zhì)(二硬脂酰磷酸乙醇胺-聚羧基甜菜堿脂質(zhì))可促進內(nèi)體/溶酶體逸出，從而增強替莫唑胺的細胞毒性并提高siTGF-β的基因沉默效率。ALBTA顯著改善了免疫抑制微環(huán)境，并延長了膠質(zhì)瘤小鼠的生存時間。其中，二硬脂酰磷酸乙醇胺等融合脂質(zhì)并入脂質(zhì)復合物中附著于陰離子膜上并與之融合來增加脂質(zhì)體和內(nèi)體膜之間的相互作用促進內(nèi)體釋放，使藥物成功進行溶酶體逃逸。

2.4 聚合物聚合物是由重復結構單元大分子組成的，通常以共價鍵結合。近年來陽離子聚合物由于其獨特的化學物理性質(zhì)，在基因傳遞及藥物傳遞方面受到了廣泛的關注。目前可供選擇的聚合物中包括聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、樹枝狀聚合物、陽離子聚合物、支化聚乙烯亞胺(branched-polyethyleneimine，BrPEI)和殼聚糖等。聚合物與納米顆粒相容形成復合物，并且這些聚合物能增強藥物的穩(wěn)定性、高效遞送和調(diào)節(jié)釋放。大多數(shù)基于聚合物的納米顆粒通過內(nèi)吞途徑進入細胞，并被包裹在內(nèi)體中。為了防止納米顆粒的降解，研究者們最近采用了不同的聚合物來修飾納米顆粒，使它們可以從內(nèi)體逃逸到細胞質(zhì)中[19]。目前，基因療法和化學療法的結合在癌癥治療中受到了很大的關注。由于低轉染效率和基因從納米載體的內(nèi)體逸出能力差，嚴重限制了小干擾RNA(siRNA)在臨床上的成功應用。Cao[20]等在研究中設計了一種新型的pH響應，表面修飾的單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNT)用于阿霉素(doxorubicin，DOX)和survivin siRNA的基因傳遞。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)與甜菜堿共價綴合，然后將所得的聚乙烯亞胺和甜菜堿復合物(polyethyleneimine betaine，PB)與氧化的SWCNT進一步合成以形成SWCNT-PB(SPB)，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的pH響應性溶酶體逃逸性。Liu[21]等為克服基因傳遞中不同的細胞內(nèi)外的屏障，通過模塊化自組裝策略制備了具有電荷轉化性質(zhì)的腫瘤靶向和pH/氧化還原反應性三元復合物。其中多聚體的ζ電位在生理pH值下是穩(wěn)定的，并且在pH5.5(內(nèi)/溶酶體pH)條件下從-14 mV迅速增加到+20 mV，這是由于酸敏感中酰胺鍵的斷裂，以及隨后對FA-PEI-AcO層的去屏蔽作用，導致復合體的內(nèi)/溶酶體逸出。Chen[22]等開發(fā)了一種獨特的pH/氧化還原雙敏感陽離子單分子納米顆粒(nanoparticles，NP)，可實現(xiàn)內(nèi)體/溶酶體逸出以及靶細胞內(nèi)部siRNA的分解，可用于腫瘤靶向的siRNA遞送。這些研究表明了設計聚合物納米顆粒在溶酶體逃逸中的重要作用，能更好地將藥物輸送到細胞中。

2.5 光敏劑光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑(photoinitiator，PI)在適當波長的光照射下產(chǎn)生有毒的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，產(chǎn)生的ROS主要是單線態(tài)氧可以破壞溶酶體，單線態(tài)氧的壽命很短，破壞范圍有限。因此，它可以破壞內(nèi)質(zhì)體/溶酶體膜，并且在不影響細胞器的情況下釋放治療內(nèi)容物。目前利用光敏劑的輔助作用已經(jīng)成為了一種用來增強生物大分子及藥物傳遞的高效的癌癥治療方法。這項技術基于光激活內(nèi)吞光敏分子，在將內(nèi)吞囊泡內(nèi)容物轉移到溶酶體之前誘導其釋放。Liu[23]等為了克服內(nèi)源性/溶酶體的限制，提高納米藥物的臨床可利用性，設計了一種基于與脂質(zhì)雙層結合的介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles tethered with lipid bilayers，MSN@TLB)的近紅外(near-infrared，NIR)刺激響應納米體系。在該納米體系中，親水性藥物分子唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)首次通過聚乙烯亞胺修飾進入介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)。為了防止運輸中有效載荷的泄漏，脂質(zhì)雙層(lipid bilayers，LB)殼通過聚乙烯亞胺緩沖共價拴在MSN核上，大大提高了LB的穩(wěn)定性。同時，在疏水室中引入疏水光敏劑IR-780，使體系具有光活化性能。在808 nm照射下，細胞內(nèi)化和內(nèi)體/溶酶體捕獲后，通過局部ROS的產(chǎn)生使光化學內(nèi)化介導的藥物產(chǎn)生釋放和溶酶體逃逸，從而實現(xiàn)高效的腫瘤光動力治療。另外Zhao[24]等將抗癌藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)和光敏劑二氫卟吩(chlorin e6，Ce6)負載到帶相反電荷的含有陽離子的聚合物中，陽離子聚合物與陰離子Ce6之間的靜電吸引，表明Ce6具有比DOX更高的負載效率。在酸性條件下，由于質(zhì)子化DOX的溶解度增加，與部分質(zhì)子化聚合物的相互作用減弱，DOX呈現(xiàn)pH響應性藥物釋放。相反，Ce6由于溶解度變化較小以及Ce6與聚合物之間的相互作用強烈而表現(xiàn)出對pH不敏感的釋放。通過光觸發(fā)活性氧，增強細胞攝取和載藥納米粒子的有效內(nèi)體/溶酶體逃逸，實現(xiàn)了腫瘤細胞的協(xié)同化療/光動力治療。

3 總結與展望

大多數(shù)納米顆粒通過內(nèi)吞途徑進入細胞內(nèi)，不可避免的被溶酶體中存在的水解酶降解，導致藥效降低，因此我們必須對其進行改造修飾。目前常用的載體如毒素和穿膜肽，其能通過成孔或與膜融合克服溶酶體逃逸，毒性較大以及轉染率不高限制了其使用。脂質(zhì)生物相容性好并且能夠減少藥物降解，但極易發(fā)生免疫反應。聚合物作為納米載體可以提高藥物生物利用率，但聚合物降解不穩(wěn)定。以及光敏劑雖然可以提高靶向性降低藥物毒性，但成分復雜穩(wěn)定性差的特點導致其使用不方便。以上納米載體雖可實現(xiàn)溶酶體逃逸，但均有一定的優(yōu)缺點。因此，必須了解不同類型的溶酶體逃逸機制，利用各種方法對不同類型的納米顆粒進行修飾，從而開發(fā)出能夠成功逃逸溶酶體的理想載體。目前，合成逃逸溶酶體的納米粒子仍然面臨很大的挑戰(zhàn)，需要研究者們進行深入的研究。