郭秀芳，屈璐璐，賈振宇，楊占坤，劉亞玲，*，蔚煒華

(1.內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司，呼和浩特 010030； 2.內(nèi)蒙古蒙草種業(yè)科技研究院有限公司，呼和浩特 010030)

土壤鹽堿化已成了日益嚴(yán)重的環(huán)境災(zāi)害[1]。近年來(lái)我國(guó)北方草原的鹽堿化面積也在不斷的擴(kuò)張[2-3]。因此，選育適宜在鹽堿化草原生長(zhǎng)的植物可在一定程度上改良鹽堿化土壤，提高土地利用率。

1 羊草的基本特性

羊草[Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.]又稱(chēng)堿草，屬于禾本科賴(lài)草屬，為異源四倍體植物[4]。研究表明，羊草具有較強(qiáng)的耐鹽堿特性，其可在pH8.5～11.5的鹽堿地上生長(zhǎng)，是非鹽生植物中耐鹽性較高的物種[5]。而且羊草產(chǎn)量高、品質(zhì)好、地下橫走根莖發(fā)達(dá)，是優(yōu)質(zhì)的牧草兼生態(tài)草[6-8]。因此，可通過(guò)大面積推廣種植羊草改良鹽堿化草原。

2 羊草耐鹽堿性研究

2.1 初期耐鹽堿性研究

羊草的耐鹽堿性研究初期主要是通過(guò)對(duì)其種質(zhì)萌發(fā)以及苗期進(jìn)行鹽堿處理，分析其生物學(xué)和生理特性。馬紅媛等[9-10]在設(shè)置了不同鹽濃度梯度處理羊草種子的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用低于50 mmol/L的NaCl處理羊草種子有促進(jìn)萌發(fā)的效果；此后在一定范圍內(nèi)，增加NaCl濃度，羊草萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，但大部分種子仍然沒(méi)有失活，且Na2CO3比NaCl對(duì)羊草種子萌發(fā)有更強(qiáng)的抑制作用。李倩等[11]用不同地區(qū)采集的100份羊草種質(zhì)進(jìn)行了萌發(fā)鹽處理實(shí)驗(yàn)，從中篩選到了極耐鹽的種質(zhì)，其在鹽脅迫下相對(duì)萌發(fā)率可達(dá)85%。以上是針對(duì)羊草種子萌發(fā)做的鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。

有文章研究羊草苗期的耐鹽堿性強(qiáng)度，如顏宏[12]的實(shí)驗(yàn)使用8周的羊草幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，用鹽處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度上升到600 mmol/L時(shí)，羊草幼苗已全部死亡；而Na2CO3處理羊草幼苗的致死濃度則是175 mmol/L。該實(shí)驗(yàn)還測(cè)量了羊草幼苗的分蘗率、光合速率、以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中這些指標(biāo)都有不同程度下降，且 Na2CO3對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響更嚴(yán)重，這和馬紅媛在研究羊草種子萌發(fā)時(shí)得出的結(jié)論相一致。徐月喬[13]研究了灰綠型羊草和黃綠型羊草的耐鹽堿性，分析了兩種生態(tài)型羊草的根際效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)灰綠型羊草能更有效地緩解鹽堿脅迫對(duì)根際 pH 的影響，并且同等鹽脅迫下，灰綠型羊草更能抵抗鹽脅迫。這些研究為篩選耐鹽堿羊草種質(zhì)和對(duì)羊草初期的耐鹽性評(píng)價(jià)提供了基礎(chǔ)。

2.2 耐鹽堿生理響應(yīng)機(jī)制

離子對(duì)植物正常生長(zhǎng)至關(guān)重要，一般情況下，鹽堿化土壤中過(guò)量的 Na+會(huì)滲透到植物體內(nèi)，打破植物細(xì)胞內(nèi)的離子和水分平衡[14-17]。研究表明，為應(yīng)對(duì)這種非生物脅迫，植物通常通過(guò)甜菜堿和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持滲透壓，另外通過(guò)檢測(cè)丙二醛、有機(jī)酸、抗氧化酶等指標(biāo)，也能側(cè)面反應(yīng)植物在逆境脅迫下的生理響應(yīng)狀況[18-21]。

劉濱碩等[22]通過(guò)對(duì)鹽堿脅迫下羊草的生理生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在受到輕中度鹽堿脅迫時(shí)，羊草通過(guò)產(chǎn)生大量甜菜堿調(diào)節(jié)滲透壓，在受到較重鹽堿脅迫時(shí)羊草根莖主要通過(guò)大量生成脯氨酸和丙二醛進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。鹽堿地中的Na+離子入侵羊草時(shí)，其根莖會(huì)持續(xù)吸收Na+直至達(dá)到飽和，這時(shí)根莖會(huì)將吸收的 Na+排到地上部分，以維持根莖中的離子平衡。

另有研究表明，與植物共生的根系微生物也可幫助植物提高抗逆性[23]。王英逵等[24]研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(AMF) 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)羊草體內(nèi)地上和地下的離子分配，增強(qiáng)羊草的鹽堿耐受性，在鹽堿脅迫下，AMF泡囊結(jié)構(gòu)幫助羊草根系截留 Na+，并促進(jìn) K+、Ca2+和 Mg2+等其他離子的吸收；也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)接種成功AM真菌的羊草與對(duì)照相比，在鹽堿脅迫下前者的生物量及葉綠素含量有較明顯的提高，但在鹽堿脅迫的環(huán)境下，AM 真菌的侵染強(qiáng)度出現(xiàn)了下降，具體機(jī)理還有待探索[25]。

2.3 耐鹽堿基因挖掘以及功能研究進(jìn)展

近年來(lái)，利用基因測(cè)序技術(shù)和分子生物技術(shù)，在羊草中挖掘出一些與耐鹽堿相關(guān)的基因。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，Jin等[26-27]用不同濃度Na2CO3和NaCl處理羊草，之后提取了處理組和實(shí)驗(yàn)中葉片和根的 RNA并構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Na2CO3處理后找到 39 個(gè)可能與鹽脅迫相關(guān)的基因，NaCl處理找到31個(gè)相關(guān)基因，更進(jìn)一步證實(shí)羊草對(duì) Na2CO3更敏感。同樣，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，通過(guò)GO以及KEGG匯聚分析，董圓圓等[28]研究了鹽脅迫下羊草中轉(zhuǎn)錄因子家族的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)WRKY、C3HL、NAC等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化明顯。

近期的研究主要集中于驗(yàn)證羊草中耐鹽堿基因的功能以及探究其調(diào)控機(jī)制。Ma等[29]從羊草中克隆到一個(gè)關(guān)于細(xì)胞質(zhì)膜傳感的基因(plasma membrane intrinsic,LcPIP1),該基因在羊草葉中大量表達(dá)，將其在酵母中過(guò)表達(dá)能提高酵母對(duì)鹽堿的耐受性。Sun等[30]從羊草中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受鈉鹽誘導(dǎo)并與真核細(xì)胞翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factor)同源性高的基因，將其命名為L(zhǎng)ceIF1，該基因提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐受性，這項(xiàng)研究豐富了EIF的功能。Cheng 等[31]從羊草中克隆了一個(gè)未知功能性MYB相關(guān)基因，將其命名為L(zhǎng)cMYB1 ，發(fā)現(xiàn)該基因被鹽、干旱、ABA誘導(dǎo)表達(dá)，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因株系中調(diào)控滲透壓的物質(zhì)脯氨酸含量高于對(duì)照，推測(cè)該基因可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游抗鹽堿基因表達(dá)。Li 等[32-33]用鹽處理羊草并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)鹽誘導(dǎo)高表達(dá)基因(Leymuschinensissalt-induced )分別命名為L(zhǎng)cSAIN1、LcSAIN2基因，在高鹽脅迫下，LcSAIN1轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻耐鹽性性狀均好于野生型。Peng等[34]從羊草中克隆了LcDREB2(dehydration responsive element-binding protein)，并探究其功能及調(diào)控機(jī)制，實(shí)驗(yàn)證明其能與羊草中的另一基因LcSAMDC2(S-Adenosyl-methionine decarboxylase) 啟動(dòng)子上的 DRE 元件結(jié)合，在羊草愈傷組織中過(guò)表達(dá)LcDREB2，會(huì)增強(qiáng)LcSAMDC2 的表達(dá)量，且將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，能提高轉(zhuǎn)基因株系的抗鹽性，表明LcDREB2與LcSAMDC2 協(xié)同作用可以提高植物抵御非生物脅迫的能力。在此基礎(chǔ)上，Liu等[35]進(jìn)一步研究LcDREB2基因的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)選擇性剪接機(jī)制表達(dá)不同的功能產(chǎn)物，進(jìn)而調(diào)控下游抗逆性基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)逆境脅迫，這也豐富了DREB的調(diào)控機(jī)制。

還有研究者在羊草中發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控離子運(yùn)輸?shù)幕颍顣晕⒌萚36]從羊草中克隆了一個(gè)液泡型 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LcNHX1，為了驗(yàn)證該基因功能，將其轉(zhuǎn)入煙草和水稻中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系更耐鹽堿；王超等[37]從羊草中克隆到一個(gè)參與H+-ATP 酶調(diào)節(jié)的基因Lc14-3-3，并發(fā)現(xiàn)其受 Na2CO3誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其可能通過(guò)參與離子泵來(lái)應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫。上述研究豐富了羊草耐鹽堿基因功能以及調(diào)控機(jī)制。

3 展望

探究羊草的耐鹽堿機(jī)制對(duì)于其他耐鹽作物以及鹽堿地的生態(tài)改良都具有重要意義。但由于其復(fù)雜的研究背景以及技術(shù)手段等限制，羊草的耐鹽堿機(jī)制研究起步較晚，一般都是對(duì)羊草種質(zhì)以及苗期進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)。已取得的一些耐鹽堿機(jī)制研究基本集中在克隆耐鹽堿基因，由于羊草沒(méi)有成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段，克隆的耐鹽堿基因只能在異源模式植物擬南芥或者水稻中驗(yàn)證，這就導(dǎo)致驗(yàn)證耐鹽堿基因功能困難，局限了對(duì)基因調(diào)控機(jī)制的深入研究。羊草今后的研究方向還是需要突破轉(zhuǎn)基因技術(shù)瓶頸，構(gòu)建成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，探究已克隆到的耐鹽堿基因之間的調(diào)控機(jī)制，以及這些基因上游響應(yīng)低溫、高鹽、ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。通過(guò)羊草耐鹽堿機(jī)理的研究，特別是進(jìn)一步挖掘耐鹽堿基因資源和種質(zhì)資源，建立分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)路線(xiàn)，培育耐鹽堿羊草新品種。