李志嶺，張劍勇，賈二濤

(1.廣州中醫(yī)藥大學 第四臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518000；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

急性痛風的發(fā)作有兩個必要的條件，一個是單鈉尿酸鹽(MSU)沉積，二是機體對于晶體產生的炎癥反應。尿酸從過飽和的關節(jié)液或血液中析出沉積于關節(jié)內，繼而引發(fā)的一系列炎癥反應[1]，臨床往往表現(xiàn)為突發(fā)的、劇烈的疼痛、紅腫。急性痛風癥狀多在1周左右不加干預便可自行消退，但是MSU卻并沒有消失。為什么炎癥反應會在刺激因素仍然存在的情況下自行消退？有許多研究者嘗試回答這個問題，目前有許多證據表明這種情況與中性粒細胞誘捕網(NETs)的形成是呈高相關性的。下面我們就痛風的自發(fā)緩解與NETs相關機制作一簡要綜述。

1 痛風的自發(fā)緩解

人們目前對于急性痛風自發(fā)緩解機制的了解十分有限，多數情況下痛風會急性發(fā)作，往往在1 d之內癥狀達到頂峰，但是即使不加任何藥物干預，7～10 d左右癥狀也會緩解[2]。因此研究者們提出了多種假說，但仍沒有形成一個被大多數研究者認可的共識。自發(fā)緩解涉及到的可能不是單一路徑，而是多種機制共同作用，比如巨噬細胞、炎癥因子及炎癥小體負調控、細胞凋亡以及我們要重點論述的NETs[3]。

2 NETosis

2.1 中性粒細胞與NETosis

首先，MSU晶體激活炎癥小體NALP3，并且巨噬細胞和肥大細胞先于中性粒細胞受到刺激，從而釋放出炎癥因子和組胺，使得中性粒細胞趨化聚集，大量的中性粒細胞能夠清除引發(fā)炎癥的異物。同時包括中性粒細胞在內的炎癥細胞釋放大量的炎癥因子和趨化因子，激活更多的炎癥細胞。為了阻斷這種正反饋循壞，機體通過中性粒細胞凋亡的形式進行調控[4]。中性粒細胞是人含量最多的白細胞，聚集到炎癥部位，經過染色質解縮和膜破裂或通過囊泡運輸的方式，核酸物質和顆粒蛋白融合并釋放到胞外而形成NETs，這個過程稱為NETosis。目前已知的催化酶主要有蛋白精氨酸脫亞胺酶(PAD)4、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO)等[5]。

中性粒細胞受到各種刺激導致鈣離子釋放激活鈣離子通道使Ca2+內流，在線粒體基質中累積的Ca2+激活了非選擇性線粒體孔隙(MPTP)與線粒體活性氧物種(mtROS)的形成，mtROS在蛋白激酶C的參與下明顯激活NADPH氧化酶[6]。活性氧(ROS)其中一個重要來源是由NADPH氧化酶產生的，ROS激活了PAD4，其在NETs形成過程中扮演了極其重要的角色。PAD屬于Ca2+結合蛋白，其活性受到Ca2+的調控[6]。PAD4催化組蛋白的瓜氨酸化，減少組蛋白強正電荷，從而弱化了組蛋白與DNA的結合，核小體因此解聚[7-8]。隨后NE從嗜天青顆粒釋放轉移到細胞核處，部分降解特定組蛋白連接物H1，并且修飾了組蛋白核心。隨后MPO很可能是通過次氯酸鹽的合成機制，二者通過共同作用使染色質進一步解聚[9-10]。解聚后DNA與瓜氨酸化的組蛋白及相關酶形成NETs排出到細胞外，從而發(fā)揮功能。凋亡的中性粒細胞很可能通過允許趨化因子受體(CCR)5的過度表達吸附趨化因子配體(CCL)3和CCL5，使其遠離目標而減弱趨化因子信號[11]。

此外，還有一種不依賴于ROS的NETs形成路徑，中性粒細胞受到刺激后同樣經過染色質解聚，與相關的酶通過囊泡的方式釋放到胞外，而殘存有少量細胞核的中性粒細胞仍具備一定遷移、吞噬的活性[12]。MSU晶體刺激形成NETs的過程是否依賴ROS仍存在爭議，有的實驗甚至得出了相反的結論[13-14]。

2.2 MiRNA與NETosis

NETs是以DNA為骨架的網狀結構，已有實驗證實NETs會攜帶一些RNA，并且多項研究證明了miRNA在NETs形成過程中的重要調節(jié)作用。

miRNA142-3p通過調控PKC通路影響巨噬細胞的極化、炎癥因子的產生等功能，進而與NETs相互作用[15]。研究者在miR-146a對NETs的調節(jié)的研究上得出了不完全一致的結果，但兩個陽性結果至少說明了miR-146a對NETs是有調節(jié)作用的[16-18]。miR-155與miR-146a類似正負反饋的模式調節(jié)NF-κB的活性，進而實現(xiàn)對炎癥的控制。miR-155通過3′-UTR區(qū)域富AU元件來調控PAD4mRNA，從而調控NETs的形成[18-20]。

還有一些潛在的miRNA可能與NETs的形成相關，比如miR-505下調參與ROS產生的一種線粒體蛋白SIRT3，并實驗觀察到了較高的NETs[21]。miR-15b-5p和miR-378a-3p通過抑制Akt/mTOR途徑的活性，從而激活機制促進NETs的形成[22]。

3 NETs與痛風炎癥消退的機制

3.1 aggNETs

必須說明，NETs在整個炎癥過程中并非只參與了炎癥消退的過程，而是非常奇特地表現(xiàn)為促炎與抗炎兩種功能，這種看似矛盾的功能形成的重要原因便是NETs的密度[23]。Schauer等[24]對比野生鼠和NETosis機制缺陷Ncf1**小鼠足趾墊注射MSU晶體后足趾炎癥反應，即野生型小鼠出現(xiàn)與人類似的痛風自限過程，而NETosis基因缺陷Ncf1**小鼠相對遲緩，而且炎癥因子水平更高，關節(jié)炎癥更重且呈現(xiàn)慢性化。在腹腔注射MSU晶體后，野生小鼠同時注射可分解aggNETs的脫氧核糖核酸酶Ⅰ，發(fā)現(xiàn)其炎癥反應與基因缺陷小鼠是相似的。同樣的，基因缺陷小鼠在MSU誘導后經由過繼轉移aggNETs來改善炎癥。NETs可以釋放白細胞介素(IL)-8，即趨化因子，用以招募中性粒細胞，當中性粒細胞達到一定濃度時，NETs相互聚集便形成了aggNETs。有實驗就已經觀察到，aggNETs外附著的絲氨酸蛋白酶能夠通過降解炎癥因子如IL-1β和趨化因子，以此來阻斷中性粒細胞趨化和促使炎癥的消退[23]。

在炎癥早期NETs密度較低，內源性大分子抗蛋白酶非常容易達到細胞網與相應的中性粒細胞絲氨酸蛋白酶(NSPs)結合，這使得NSPs難以發(fā)揮對細胞因子和趨化因子的水解作用。但是，aggNETs是一種高密度、更大面積的NETs聚集體，它的結構更加緊密。在炎癥區(qū)域與健康組織之間形成屏障，防止了炎癥的蔓延[25]。并且aggNETs能夠有效地阻擋大分子物質的進入，而像炎癥因子和趨化因子這種小分子蛋白仍然可以進入。沒有了抗蛋白酶的抑制，NSPs能夠非常高效地水解促炎因子，阻斷了中性粒細胞聚集和激活的循環(huán)，從而使炎癥消退[26]。不同誘因誘導的aggNETs在炎癥因子降解能力上是不存在差異的[27]。

3.2 NETs的平衡

由于NETs的成分及結構的特性使其具有抗原性，這意味著NETs與炎癥的持續(xù)狀態(tài)，尤其是自身免疫性炎癥疾病是呈相關性的。因此，維持NETs含量的平衡對于炎癥反應來說也是至關重要的[26]。其中NETs的原料——中性粒細胞的凋亡，對維持NETs平衡有著重要的意義[28]。

3.2.1 巨噬細胞吞噬 炎癥反應中巨噬細胞的作用同樣不容忽視，聚集的巨噬細胞可以清除細胞碎片及異物，已有研究者注意到巨噬細胞與NETs之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內MSU晶體刺激下巨噬細胞發(fā)生極化，使得具有抗炎作用的酶-血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)合成和分泌增多[29]，并且導致上調了CIS(SOCS蛋白家族)和SOCS3表達，進而降低了IL-1β和腫瘤壞死因子α。激活了轉化生長因子(TGFβ1-)啟動子，TGF-β1是非常重要的限制炎癥因子，巨噬細胞快速清除凋亡的中性粒細胞也可以促進TGF-β1的分泌。短蛋白吡咯結構域和含caspase結構域能夠干擾凋亡相關斑點樣蛋白ASC對脂多糖的反應，調節(jié)炎癥小體的激活。在人類體外實驗中，損傷相關分子模式(DAMPs)誘導的TLR信號的負調控因子可以關閉無菌炎癥的因素[3]。在TGF-β1的相關作用下，具有抗炎作用的M2型巨噬細胞表現(xiàn)了更高的吞噬能力，而人類巨噬細胞能夠吞噬中性粒細胞及NETs。巨噬細胞分泌的很多介質均已被證明能夠促使NETs的形成，已經有研究者觀測到了巨噬細胞吞噬NETs的現(xiàn)象，這個過程是通過DNase Ⅰ對NETs的胞外預處理以及NETs與C1q的調理來促進的，并且這個過程保持了免疫沉默[30-31]，也就是說巨噬細胞同樣參與到了NETs抗炎過程，而且維持NETs水平的動態(tài)平衡。

3.2.2 中性粒細胞凋亡 中性粒細胞壞死性凋亡(necroptosis)是一種受調控的程序性細胞死亡，我們對它的了解遠不如細胞凋亡。有研究表明,在MSU的刺激下通過激活NADPH氧化酶復合物的組裝和活性與ROS的產生，進而影響NETs的形成。之后的實驗表明，至少壞死性凋亡與NETosis是呈相關性的。與壞死性凋亡不同，細胞凋亡為了限制有害中性粒細胞的釋放，保持了細胞膜的完整，并暴露膜上的磷脂酰絲氨酸殘基，以便巨噬細胞的識別與吞噬。并且凋亡的中性粒細胞還刺激了巨噬細胞產生抗炎因子IL-10和TGF-β1[28]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1(AnxA1)能夠調節(jié)中性粒細胞在關節(jié)中的募集，通過誘導中性粒細胞凋亡和清除而減輕痛風的炎癥反應。并且發(fā)現(xiàn)用AnxA1活性N端肽預處理小鼠可減少關節(jié)周圍中性粒細胞內流以及IL-1β、CCL1的產生[32]。ω-3脂肪酸是必需脂肪酸，能夠通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR40和GPR120特異性地，至少部分性抑制NLRP3炎癥小體激活以及抑制高脂飲食誘導的NLRP3炎癥小體的激活，并且能夠限制中性粒細胞趨化進而誘導炎癥的消退。還有研究[33]證明，短鏈脂肪酸能夠誘導中性粒細胞凋亡從而緩解炎癥。

4 中性粒細胞微囊泡與NETs和炎癥消退

微囊泡(microvesicles，MVs)參與細胞間的信號轉導與功能調控，因而在生理及病理狀態(tài)下均可產生[34-36]。中性粒細胞衍生的微囊泡(NDMVs)被認為是位于炎癥局部的中性粒細胞通過膜的起泡和脫落產生的。有研究[37]發(fā)現(xiàn)瓜氨酸組蛋白H3(H3Cit)與MVs之間結合，能夠延長H3Cit的壽命，也就是說MVs可能是與NETs結合并且對NETs起到了一定的保護作用。

NDMVs能夠通過抑制自然殺傷細胞、巨噬細胞、軟骨細胞等炎癥基因表達發(fā)揮抗炎功能。此外，還有研究者在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)NDMVs增加軟骨細胞產生TGF-β來減少炎癥關節(jié)炎軟骨損傷[38]。有實驗發(fā)現(xiàn)MVs能夠下調巨噬細胞的細胞活性，通過在早期階段抑制C5a介導的NLRP3炎癥小體相關的IL-1β的釋放以及通過誘導巨噬細胞分泌TGF-β1起到抗炎作用[11,39]。

中性粒細胞衍生痕跡(NDTRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的與NDMVs功能不同的胞外小泡。與抑制炎癥不同的是，NDTRs有更高的促炎miRNAs的表達，并且誘導巨噬細胞向促炎表型即M1型級化。NDTRs的產生很可能是炎癥過程中非特異性的，雖然NDTRs具有促炎作用，但是卻降低了膿毒癥小鼠的致死率和慢性結腸炎小鼠模型的病理改變。適度的炎癥反應是機體的自我保護機制，并非是絕對有害的，NDTRs就是在早期中性粒細胞遷移到炎癥過程中產生的促炎因素，NDMVs則抑制過度炎癥，減少對機體的損害。因此，無論NDTRs還是NDMVs可能都是對機體的一種保護機制[38,40]。

5 小 結

對急性痛風的自然消退機制的探索至今仍處于初級階段，根據目前掌握的科研證據，這個過程是涉及多方面的。NETs無疑是其中重要的環(huán)節(jié)，中性粒細胞受到各種炎癥因子和趨化因子的作用而聚集于關節(jié)囊內的MSU晶體沉積部位，并且受到酶的剪切等作用而程序性死亡，最終形成NETs，并且隨著炎癥反應的進行，NETs逐漸聚集而形成aggNETs，從而發(fā)揮抗炎作用，無論是對無菌性炎癥如痛風，亦或是感染性疾病都發(fā)揮了一定的積極作用，值得我們關注[41]。生命體是非常精密的、智能的，懂得矯枉而不過正，因此作者還綜述了機體維持NETs含量平衡的機制，包括可能有延長NETs生存長度作用的MVs，這也是多種機制中不可或缺的一環(huán)，應當引起我們的重視。