劉曉婷，姚 拓，馬亞春，柴加麗

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種微量的天然有機(jī)小分子化合物，能從產(chǎn)生部位運(yùn)往作用部位，在細(xì)胞分裂、分化與種子萌發(fā)、休眠以及植物生長(zhǎng)、生殖、成熟和衰老等方面起著重要作用[1-2]。自然界中不僅植物可以產(chǎn)生植物激素，許多細(xì)菌也能產(chǎn)生植物激素[3]。研究表明，植物根際促生菌產(chǎn)生的植物激素在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著巨大的作用，促生菌既可以通過分泌植物激素改良作物株型，提高作物產(chǎn)量，又可以通過分泌植物激素參與調(diào)控作物對(duì)各種生物或非生物脅迫的適應(yīng)性而增加作物產(chǎn)量[4-5]。在過去的30 年中，化肥在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效中的作用顯而易見，但長(zhǎng)期不合理施用化肥也帶來土壤肥力下降、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)低下、農(nóng)作物病蟲害增加、生態(tài)環(huán)境被破壞等一系列不良后果。微生物肥料作為一種新型肥料，以其促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆性、改良土壤等優(yōu)點(diǎn)而被開發(fā)應(yīng)用[6-7]。高效多功能促生菌資源是研制微生物肥料的重要原料。然而，與固氮、溶磷菌不同，分泌植物激素菌目前還沒有特定的選擇性培養(yǎng)基，其分離過程往往不是定向的，而是通過其他促生菌篩選的[8-9]，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)植物根際促生菌中植物激素的含量，是篩選分泌植物激素菌的重要前提，而這就要求發(fā)展準(zhǔn)確高效的定性定量分析方法。

植物根際促生菌產(chǎn)生的植物激素含量極低，性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)提取環(huán)境較敏感，而且菌株發(fā)酵產(chǎn)物中含有大量的細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物，直接檢測(cè)會(huì)受到色素、次生代謝物等干擾物的影響，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此選擇合適的樣品前處理方法及分離檢測(cè)方法對(duì)測(cè)定植物激素極其重要[10-12]。近年來，高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)在植物激素分析領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，具有對(duì)目標(biāo)物分離效率高、定性定量準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏度高、儀器維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前植物激素分析檢測(cè)中的常用方法[13-16]。關(guān)于植物根際促生菌中植物激素的檢測(cè)分析，有研究使用固相萃取和免疫親和純化等對(duì)植物根際促生菌發(fā)酵液中的植物激素進(jìn)行提取純化[17-18]，而針對(duì)改進(jìn)的液-液萃取技術(shù)對(duì)植物根際促生菌中的植物激素進(jìn)行提取富集的研究較少。鑒于此，為快速準(zhǔn)確測(cè)定植物根際促生菌發(fā)酵產(chǎn)物中的植物激素含量，本研究采用液液萃取-高效液相色譜法，建立一種同時(shí)測(cè)定植物根際促生菌中吲哚乙酸、赤霉素、玉米素3 種植物激素含量的分析方法，以期增進(jìn)對(duì)植物根際促生菌中植物激素作用機(jī)制的了解，并為豐富我國(guó)的菌種資源庫提供參考。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；YJCY-202T 疊加搖床(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；H1850R 高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；RVC 2-25 真空離心濃縮儀(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；AK-ROUP-250 超純水制備儀(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；225D-1CN 精密電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；0.45 μm 一次性微孔濾器(甘肅艾爾維科學(xué)儀器有限公司)。

吲哚乙酸、玉米素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 98%)、赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 90%) 均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙酸乙酯(色譜純，甘肅艾爾維科學(xué)儀器有限公司)、冰乙酸(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；試驗(yàn)所有用水均為超純水；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

供試菌株MBM5 (Pseudomonas sesame)、PAM12(Pseudomonas mohnii)是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性課題組前期從紅原高寒草地優(yōu)勢(shì)牧草毛稃羊茅(Festuca kirilowii)根際分離的2 株優(yōu)良植物根際促生菌，現(xiàn)保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg 分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。分別準(zhǔn)確吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

將2 株促生菌菌株經(jīng)活化后接種于King 氏培養(yǎng)基[19](已滅菌)中，每個(gè)菌株3 個(gè)重復(fù)，15 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)7 d。吸取20 mL 各菌株培養(yǎng)液，4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，棄掉菌體收集上清液，加入等體積超純水和兩倍體積的乙酸乙酯重復(fù)萃取兩次。合并乙酸乙酯層，經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮至近干，以甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm 一次性微孔濾器過濾后注入2 mL 棕色樣品瓶中，待高效液相色譜分析。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相采用體積比為45 ∶ 55的甲醇-水(含0.2%冰乙酸)；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

取3 種植物激素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，依據(jù)文獻(xiàn)[17]選擇在190～400 nm 進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果顯示，吲哚乙酸的最大吸收波長(zhǎng)為255 nm，赤霉素的最大吸收波長(zhǎng)為239 nm，玉米素在205 nm 和254 nm處各有一個(gè)特征吸收峰，且254 nm 處吸收峰大于205 nm 處的吸收峰。綜合分析，3 種植物激素在254 nm波長(zhǎng)下均有良好吸收，因此選取254 nm 波長(zhǎng)用于吲哚乙酸、玉米素、赤霉素含量的測(cè)定。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的選擇會(huì)對(duì)樣品中激素的分離度以及峰形產(chǎn)生重要影響?？疾炝肆鲃?dòng)相對(duì)植物激素分離的影響，直接以甲醇-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，3 種植物激素的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品峰形較差，色譜峰拖尾嚴(yán)重。由于3 種植物激素均為弱酸性物質(zhì)，較易電離，因此在流動(dòng)相中添加少量酸可抑制其離子化，改善吲哚乙酸、玉米素、赤霉素在色譜柱上的分離度和色譜峰峰形。當(dāng)水溶液中加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的冰乙酸時(shí)，植物激素分離效果好且色譜峰峰形良好。因此， 流動(dòng)相最終確定為流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為含0.2% (體積分?jǐn)?shù))的冰乙酸水溶液，以進(jìn)一步提高色譜分離度。在選定的色譜條件下，3 種植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液在254 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖如圖1所示。

圖1 混合激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Figure 1 Chromatogram of the standard mixture of hormones

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

在選定的條件下，對(duì)3 種植物激素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg·mL-1)，作線性回歸方程。結(jié)果顯示：赤霉素、吲哚乙酸、玉米素分別在26.68～111.11、10.67～44.44、10.67～44.44 μg·mL-1質(zhì)量濃度內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。以信噪比(S/N)為3 確定各植物激素的檢出限(limits of detection, LOD)，以S/N 為10 確定各植物激素的定量限(limits of quantitative, LOQ)。結(jié)果表明：該方法中3 種植物激素的LOD 為0.01～0.75 μg·mL-1，LOQ 為0.03～2.50 μg·mL-1(表1)。

表1 植物激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限和定量限Table 1 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection (LOD),and limits of quantitative (LOQ) of plant hormones

2.3 精密度試驗(yàn)

取1.2 中混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，赤霉素、吲哚乙酸、玉米素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.77%、2.53%和1.92%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)選取按1.3 中方法制備好的樣品溶液一份，按選定的色譜條件分別在0、2、4、8、12 和24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，赤霉素、吲哚乙酸、玉米素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.54%、1.80%和0.48%，表明供試樣品溶液中3 種植物激素在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取一個(gè)促生菌菌株，按1.3 中方法平行制備6 份，按選定的色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，供試樣品溶液中赤霉素、吲哚乙酸、玉米素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.34%、1.68% 和0.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取菌株發(fā)酵液樣品各6 份，其中3 份添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外3 份不加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.3 中方法處理后，按選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，各植物激素的回收率存在差異，同一激素在不同植物根際促生菌中的回收率也有所不同。3 種植物激素的平均回收率在88.02%～108.40%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%～6.51% (表2)，表明該方法準(zhǔn)確可靠，滿足植物根際促生菌中3 種植物激素的檢測(cè)要求。

表2 植物激素的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)Table 2 Recovery and relative standard deviation of 3 plant hormones (n = 3)

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

采用上述高效液相色譜法測(cè)定2 株促生菌MBM5 和PAM12 中的3 種植物激素分泌量。色譜圖顯示，促生菌中3 種激素可完全分離，峰形良好(圖2)。2 株促生菌株均能產(chǎn)生植物激素，菌株MBM5 的赤霉素、吲哚乙酸、玉米素分泌量分別為13.20、1.76 和1.77 μg·mL-1，菌株P(guān)AM12 的赤霉素、吲哚乙酸、玉米素分泌量分別為24.78、1.79 和2.44 μg·mL-1。菌株MBM5 和PAM12 中3 種植物激素含量差異較大，赤霉素的含量明顯高于吲哚乙酸和玉米素的含量，因此這2 株促生菌菌株可以作為優(yōu)良的產(chǎn)赤霉素的菌種資源。

圖2 測(cè)定實(shí)際樣品促生菌MBM5 和PAM12 的色譜圖Figure 2 Chromatograms of the MBM5 strain and PAM12 strain

3 討論與結(jié)論

樣品前處理是植物激素分析中的關(guān)鍵步驟之一，直接影響后續(xù)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和精密度。由于植物根際促生菌分泌的植物激素含量極低，又含有色素、中間代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的干擾，分析前選擇適當(dāng)?shù)募兓透患椒▽?duì)植物激素進(jìn)行準(zhǔn)確定量至關(guān)重要[20]。關(guān)于植物激素的前處理方法，有研究采用固相萃取技術(shù)，該技術(shù)具有溶劑消耗少，而且可供選擇的固定相種類較多、快速可靠等優(yōu)點(diǎn)。采用固相萃取小柱雖然能對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行純化和富集，但也存在前處理方法操作耗時(shí)、萃取小柱容易堵塞等不足，而且洗脫液的酸度和溶劑的比例很大程度上決定了洗脫液的洗脫能力，如果不能進(jìn)行合理選擇和優(yōu)化，難以保證目標(biāo)化合物被最大限度的洗脫，損失較大[21-23]。本研究的前處理方法不需要通過固相萃取柱，經(jīng)萃取、真空離心濃縮，用甲醇復(fù)溶后過濾膜即可直接上機(jī)進(jìn)樣分析，可以滿足樣品處理過程簡(jiǎn)單、方便的分析要求，而且還極大地縮短了樣品前處理所需的時(shí)間。

目前，關(guān)于植物根際促生菌中植物激素的檢測(cè)方法有免疫分析法、電化學(xué)分析法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)[24]。高效液相色譜法是植物激素測(cè)定中的一種常用方法，它結(jié)合了質(zhì)譜的高靈敏度及色譜分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確性，而且其儀器維護(hù)成本低，可實(shí)現(xiàn)多種植物激素的同時(shí)檢測(cè)[25-26]。與免疫分析法相比，高效液相色譜法準(zhǔn)確度更高，對(duì)激素的提純精度更高，同時(shí)可避免分析過程中一些放射性元素對(duì)操作者身體造成的損傷及次生代謝物與抗體出現(xiàn)交叉反應(yīng)影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性[27-28]。與色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，高效液相色譜法避免了較為繁瑣的衍生化處理過程，大大簡(jiǎn)化了樣品前處理過程中的工作量[29]。通過對(duì)電化學(xué)分析法研究發(fā)現(xiàn)，在促生菌發(fā)酵產(chǎn)物中其本身的pH 及溶液性質(zhì)會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生很大的影響[30]，而高效液相色譜法則能在很大程度上減少這方面的不足，成為被普遍認(rèn)可和接受的植物激素檢測(cè)手段。綜上所述，液液萃取-高效液相色譜法可以為植物根際促生菌中植物激素的同時(shí)測(cè)定提供一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的方法。

本研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定植物根際促生菌中3 種植物激素分泌量的分析方法。該方法快速簡(jiǎn)單，靈敏度高，3 種植物激素的平均回收率為88.02%～108.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%～6.51%，可以實(shí)現(xiàn)植物根際促生菌中植物激素分泌量的準(zhǔn)確測(cè)定。應(yīng)用建立的方法，進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，均滿足檢測(cè)分析要求。2 株促生菌菌株均具有較高的產(chǎn)赤霉素能力，可為今后微生物肥料的研制應(yīng)用提供優(yōu)良菌種資源。