張亞麗，王 楠，張 崗，何懿菡，顏永剛，高 靜

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 陜西 西安 712046；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 /秦藥特色資源研究與開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育), 陜西 咸陽(yáng) 712083）

水通道蛋白(aquaporins, AQPs)，屬于膜內(nèi)在蛋白MIP (major intrinsic protein)家族，介導(dǎo)細(xì)胞與介質(zhì)之間水分快速運(yùn)輸，在維持細(xì)胞膨壓調(diào)節(jié)水分平衡中起重要作用[1]。除此之外，AQPs 還可以通過(guò)選擇性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)甘油、尿素、硼酸、氨和CO2等物質(zhì)，在植物種子萌發(fā)、細(xì)胞分化及抵御逆境等過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用[2-3]。自Maurel 等[4]在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離出第一個(gè)植物水通道蛋白γ-TIP，迄今，已在玉米(Zea mays)[5]和水稻(Oryza sativa)[6]等多個(gè)植物中發(fā)現(xiàn)并被鑒定。植物水通道蛋白基因可以分為4 個(gè)亞家族，即質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast membrane intrinsic proteins, TIPs)、類NOD26 膜內(nèi)在蛋白(nodulin26-like intrinsic proteins, NIPs)和小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)[7]。不同亞組水通道蛋白均由4 個(gè)單體組成，每個(gè)單體由6 個(gè)跨膜螺旋段(TM1-TM6)和2 個(gè)短螺旋段中的Asn-Pro-Ala (NPA)序列組成。其中跨膜結(jié)構(gòu)氨基酸鏈在膜兩側(cè)形成5 個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)(LA-LE)，并且NPA 中存在芳香族化合物/精氨酸(aromatic/arg,Ar/R)模體結(jié)構(gòu)[8]，該模體分別由螺旋2 (TM2)和螺旋5 (TM5)上各一個(gè)氨基酸殘基以及E 環(huán)上的兩個(gè)氨基酸殘基(LE1 和LE2) 組成。Froger 等[9]還發(fā)現(xiàn)AQPs 中存在(P1-P5) 5 個(gè)關(guān)鍵殘基位置(Froger 位點(diǎn))，其在決定運(yùn)輸水分子或甘油分子中起重要作用。也有研究表明NPA 和Ar/R 可作為兩個(gè)“濾器”，能通過(guò)控制水孔大小及疏水性決定底物的特異性[8]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育中會(huì)受到干旱、鹽、低溫和金屬離子等非生物脅迫[10]。AQPs 作為多功能蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)水分吸收、分布及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸來(lái)提高耐受性[2,11]，從而應(yīng)對(duì)脅迫產(chǎn)生的負(fù)面影響。研究表明，香蕉(Musa acuminata)MaPIP1;1在擬南芥中異源表達(dá)后，通過(guò)降低膜損害、提高離子濃度以及維持滲透平衡等方式增加植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[12]；黃瓜(Cucumis sativus)CsPIP1;2和CsPIP2;4以及煙草(Nicotiana tabacum)NtPIP1;1和NtPIP2;1在干旱脅迫后都下調(diào)表達(dá)，用以抵御水分脅迫[13]。除此之外，GmPIP1;6可以使處于鹽脅迫條件下大豆(Glycine max)的抗鹽能力有所提高[14]。有報(bào)道顯示，大多數(shù)植物AQPs可以通過(guò)響應(yīng)非生物脅迫信號(hào)來(lái)影響基因的表達(dá)，利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變通道分子的開(kāi)關(guān)、活性、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集從而維持植物體內(nèi)水分平衡，提高植物抗逆性[15]。

甘草(Glycyrrhiza uralensis)是常用的大宗藥材，為豆科(Leguminosae)植物多年生草本。研究表明，甘草的核心產(chǎn)區(qū)為寧夏、內(nèi)蒙古、甘肅和新疆等西北干旱和鹽堿地帶[16]。其中干旱、鹽脅迫、低溫脅迫是影響甘草品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素，因此本研究利用已公布的甘草基因組信息篩選出GuAQPs基因家族成員，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和逆境脅迫下基因的表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步深入研究甘草抗逆機(jī)理并挖掘潛在的抗性基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理?xiàng)l件

甘草種子采購(gòu)于新疆烏拉爾，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)黃文靜副教授鑒定為甘草。將種子用30%過(guò)氧化氫消毒30 min 后置于25 ℃氣候箱中催芽，一周后挑選生長(zhǎng)健康、大小一致的幼苗移栽于采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(Hoagland)培養(yǎng)的裝置中，采用Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液(成分：硝酸鈣945 mg?L-1、硫酸鉀607 mg?L-1、磷酸二氫氨115 mg?L-1、硫酸鎂493 mg?L-1、EDTA 鐵鈉鹽20 mg?L-1、硫酸亞鐵2.86 mg?L-1、硼 砂4.5 mg?L-1、硫 酸 錳2.13 mg?L-1、硫 酸 銅0.05 mg?L-1、硫 酸 鋅0.22 mg?L-1和 硫 酸 銨0.02 mg?L-1)培養(yǎng)30 d。然后，用Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液為溶劑配處理液：15% 聚乙二醇(polyethylene glycol 6000, PEG-6000)溶 液、150 mmol?L-1氯 化 鈉(sodium chloride,NaCl)溶液、60 μmol?L-1脫落酸(abscisic acid, ABA)溶液分別模擬干旱脅迫、鹽脅迫、ABA 處理，將Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的甘草置于10 ℃氣候箱模擬低溫處理，以Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液室溫培養(yǎng)為對(duì)照組。于處理0 h、24 h、48 h 和7 d 時(shí)間點(diǎn)取干旱脅迫(PEG)、鹽脅迫(NaCl)、ABA 和低溫處理后的甘草根和葉，用滅菌水沖洗后液氮速凍，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，其中各處理組分別設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 GuAQPs 基因家族的鑒定

根據(jù)日本研究者M(jìn)ochida 等[17]發(fā)表的甘草基因組序列，對(duì)甘草AQPs基因家族進(jìn)行篩選鑒定。甘草基因組序列原始數(shù)據(jù)已保存在日本DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)，其生物工程ID 為PRJDB3943。基因組組裝和注釋數(shù)據(jù)集可在http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/download.pl 下載。從數(shù)據(jù)庫(kù)DDBJ 下載甘草基因組數(shù)據(jù)作為本地Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)，在https://www.arabidopsis.org/下載擬南芥AQPs 序列作為查詢序列進(jìn)行比對(duì)，初步獲得GuAQPs家族成員候選序列，候選序列采用Pfam (http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)后篩去不含保守結(jié)構(gòu)域的基因，最終鑒定到43 個(gè)GuAQPs基因家族成員。

1.3 GuAQPs 系統(tǒng)進(jìn)化分析與命名

利用ClustalW 算法將甘草和擬南芥的AQPs 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7.0 軟件采用Maximum Likelihood 方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[18]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，參考擬南芥、水稻以及玉米的AQPs 命名法[5-6,19]對(duì)GuAQPs 蛋白命名，將GuAQPs 分為PIPs、TIPs、NIPs 和SIPs 4 類。

1.4 GuAQPs 蛋白特征及保守性分析

GuAQPs 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)采用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析。GuAQPs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/TMHMM/)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)。利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用Net phos 3.1server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)與擬南芥的蛋白多序列比對(duì)結(jié)果及參考其他植物AQPs 多序列比對(duì)推測(cè)兩個(gè)NPA 基序、Ar/R濾器及Froger 位點(diǎn)(P1-P5)的氨基酸殘基[6,20]。

1.5 GuAQPs 基因結(jié)構(gòu)、Motif 及順式作用元件

從甘草基因組中提取GuAQPs基因結(jié)構(gòu)信息，利用在線軟件TBtools 繪制基因結(jié)構(gòu)圖。使用MEME (http://meme.Nbcr.net/meme)網(wǎng)站分析氨基酸序列，得到GuAQPs 蛋白保守基序。通過(guò)Plant CARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantc are/html/)預(yù)測(cè)GuAQPs順式作用元件[21]。

1.6 非生物脅迫下GuAQPs 轉(zhuǎn)錄組分析

以陜西省中管局“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥用植物生理生態(tài)課題組前期獲得的甘草在高鹽(150 mmol?L-1NaCl)和干旱(15% PEG-6000)脅迫處理7 d后的地上部分和地下部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)[22]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用HTSeq-count 軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的reads count，對(duì)reads count 進(jìn)行均一化處理采用的是RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)法，使用union 模型對(duì)各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，篩選出GuAQPs基因，用對(duì)照組與處理組之間的差異表達(dá)倍數(shù)Log2FC (fold change)值運(yùn)用TBtools 工具繪制熱圖。

1.7 不同處理下GuAQPs 表達(dá)分析

GuAQPs基因家族的CDS 序列從甘草數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，qRT-PCR 所用引物由生工生物工程股份有限公司(上海)設(shè)計(jì)并合成(表1)。甘草RNA 的提取采用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒(天根，北京)，用瓊脂糖凝膠電泳法和NanoDrop One 核酸蛋白濃度檢測(cè)儀(賽默飛)檢測(cè)RNA 質(zhì)量和濃度。采用FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒(天根，北京)合成互補(bǔ)DNA 的第一鏈(cDNA)，采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根，北京) 和qTOWER2.0實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(德國(guó))進(jìn)行qRT-PCR。Actin為內(nèi)參基因[23]，采用2-ΔΔCT計(jì)算GuAQPs基因相對(duì)表達(dá)量[24]。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理使用Excel 2013，方差分析和顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 26，并使用Graphpad 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GuAQPs 基因的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Pfam 從初步得到的甘草AQPs 中進(jìn)一步篩選出具有水通道蛋白典型保守結(jié)構(gòu)域MIP 的蛋白(圖1)，最終從甘草全基因組中鑒定到43 個(gè)AQPs家族成員(GuAQPs)，通過(guò)與擬南芥AQPs 蛋白多序列比對(duì)，將43 個(gè)GuAQPs 分為4 類，包括11 個(gè)PIPs、15 個(gè)TIPs、11 個(gè)NIPs 以 及6 個(gè)SIPs，其 中PIPs 亞家族被聚類為PIPs1 和PIPs2 兩個(gè)分支(圖2)。依據(jù)此結(jié)果，參考其他植物水通道蛋白命名法，對(duì)其命名如表2 所示。

圖2 擬南芥和甘草AQPs 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of AQPs of Arabidopsis thaliana and Glycyrrhiza uralensis

2.2 GuAQPs 蛋白特征與保守性氨基酸殘基的分析

GuAQPs 蛋白氨基酸長(zhǎng)度介于106 (GuPIP2;6)～789 aa (GuPIP7;1) (表2)，其分子量大小介于11.28(GuPIP2;6)～87.82 kD (GuPIP7;1)。等電點(diǎn)(pI) 值最大為10.09 (GuSIP1;3)，最小為4.46 (GuTIP2;3)。TIPs亞家族中除GuTIP3;2 和GuTIP4;1 外，其等電點(diǎn)均小于7。不穩(wěn)定系數(shù)除GuTIP5;1 外均小于40，脂肪系數(shù)都在100 左右，總平均親水性除GuNIP7;1 和GuTIP1;8 外均大于0，說(shuō)明GuAQPs 多為疏水性穩(wěn)定蛋白。GuAQPs 二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明(表3)，甘草TIPs 亞家族大多定位于液泡，NIPs、PIPs 和SIPs 亞家族大多定位于細(xì)胞膜，其中GuNIP7;1 定位于葉綠體膜。GuAQPs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占比例介于19.91%～55.23%，β-轉(zhuǎn)角介于2.09%～8.33%，無(wú)規(guī)則卷曲介于24.27%～50.94%。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，GuAQPs 蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)生在絲氨酸(serine, Ser)、蘇氨酸(threonine,Thr)以及酪氨酸(tyrosine, Tyr) 3 種氨基酸殘基上，其中發(fā)生在絲氨酸(Ser)位點(diǎn)的磷酸化個(gè)數(shù)較其他兩個(gè)氨基酸殘基多。GuAQPs 一般具有6 個(gè)左右的跨膜結(jié)構(gòu)(表3)，其中GuNIP2;1 含有12 個(gè)，GuTIP1;8不含跨膜結(jié)構(gòu)。另外，GuAQPs 的Ar/R 濾器及P1-P5 的氨基酸殘基以及LB 和LE 的兩個(gè)NPA 基序均具有一定的保守性(表4)。

表2 GuAQPs 家族理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of GuAQPs family genes

續(xù)表2Table 2 (Continued)

表3 GuAQPs 二級(jí)結(jié)構(gòu)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 3 Secondary structure and phosphorylation site prediction of GuAQPs

續(xù)表3Table 3 (Continued)

表4 GuAQPs 的NPA 基序、Ar/R 選擇性濾器及Froger 位點(diǎn)氨基酸殘基Table 4 NPA motifs and amino acid residues found in Ar/R selectivity filter and Froger’s position of GuAQPs

續(xù)表4Table 4 (Continued)

2.3 GuAQPs 基因結(jié)構(gòu)和motif 分析

對(duì)GuAQPs基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析(圖3 C)，結(jié)果表明，GuAQPs基因家族的內(nèi)含子有0～12個(gè)不等，除GuSIP1;3、GuSIP2;2和GuPIP2;6基因不含內(nèi)含子外，其余40 個(gè)基因均具有內(nèi)含子，多數(shù)含有2～4 個(gè)內(nèi)含子，其中16 個(gè)基因含有兩個(gè)內(nèi)含子，11 個(gè)基因含有3 個(gè)內(nèi)含子，5 個(gè)基因含有4 個(gè)內(nèi)含子。進(jìn)一步分析得GuNIP1;1、GuNIP1;2、GuNIP2;1、GuSIP2;1、GuSIP1;4和GuSIP1;1具有較長(zhǎng)內(nèi)含子，整體看，甘草PIPs 和TIPs 亞家族基因長(zhǎng)度均在4 000 bp 以內(nèi)，比NIPs 和SIPs 亞家族短。

通過(guò)MEME 在線工具對(duì)GuAQPs 進(jìn)行Motif分析(圖3B)，結(jié)果表明，同一亞家族Motif 的分布較為一致，SIPs 亞家族所含Motif 數(shù)量最少，平均5 個(gè)Motif，另外3 個(gè)亞家族都含有較多的Motif，平均8～9 個(gè)Motif。進(jìn)一步分析得出(圖3D)，93%的GuAQPs 都含有質(zhì)膜水通道蛋白的特征信號(hào)序列TGINPARSLGAA (用 紅 框 標(biāo) 出)，76.7% 的GuAQPs都含有MIP 家族的信號(hào)序列SGXHXNPAVT (用藍(lán)框標(biāo)出)。Motif 3 和Motif 9 為PIPs 亞家族特有基序，并且PIPs 亞家族不含Motif 7。此外，每個(gè)亞家族的保守基序在種類和所在位置上保持高度相似，從側(cè)面印證了系統(tǒng)發(fā)育分析的可靠性，而存在于不同亞家族之間特異的保守基序可能與GuAQPs 功能的多樣性有關(guān)。

圖3 GuAQPs 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(A)、保守基序分布(B)、基因結(jié)構(gòu)(C)和保守氨基酸序列(D)Figure 3 Phylogenetic tree (A), conserved motif distribution (B), gene structure (C),and conserved amino acid sequence (D) of GuAQPs family genes

2.4 GuAQPs 啟動(dòng)子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)模式分析

利用Plant CARE 對(duì)啟動(dòng)子前2 000 bp 序列進(jìn)行分析(圖4A)，檢測(cè)到多種與植物生長(zhǎng)、激素以及環(huán)境相關(guān)的順式作用元件。將近97%的GuAQPs都參與光應(yīng)答，含有與厭氧誘導(dǎo)、柵欄葉肉細(xì)胞分化調(diào)控、分生組織調(diào)控、胚乳應(yīng)答及細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的GuAQPs分別占88%、9%、49%、27%和6%；能響應(yīng)ABA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、水楊酸(salicylic acid, SA)、赤霉素(gibberellin, GA)和生長(zhǎng)素(auxin, IAA)的GuAQPs分別占總GuAQPs的81%、60%、56%、44% 和23%；近32% 和39% 的GuAQPs分別參與低溫應(yīng)答和防御和脅迫應(yīng)答。除此之外，TIPs 亞家族所含有的元件數(shù)相對(duì)其他家族多，PIPs亞家族含有較多低溫響應(yīng)元件，SIPs 亞家族所含元件種類和數(shù)量都最少。

GuAQPs基因在干旱脅迫后地上部分上調(diào)表達(dá)基因有27 個(gè)，3 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖4B)，地下部分有13 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)基因有16 個(gè)。在鹽脅迫下地上部分有17 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，4 個(gè)下調(diào)表達(dá)。地下部分有13 個(gè)基因上調(diào)，11 個(gè)表達(dá)下調(diào)。GuNIP4;2、GuNIP7;1、GuSIP2;1、GuTIP1;1、GuTIP1;4、GuTIP1;5、GuTIP1;8、GuTIP3;1和GuTIP5;1這9 個(gè)基因在干旱和鹽脅迫下其表達(dá)量在地下部分中都沒(méi)有顯著變化(P ＞0.05)。其中GuNIP1;1、GuNIP1;2及GuTIP3;2在PEG 處理下地上部分表達(dá)量顯著升高(P＜ 0.05)，GuTIP1;1和GuTIP1;2所含啟動(dòng)子種類和數(shù)目差不多，但GuTIP1;2在鹽處理和干旱處理下表達(dá)較為顯著(P＜ 0.05)，這可能和GuTIP1;2含有一個(gè)響應(yīng)防御和脅迫的元件有關(guān)。

圖4 GuAQPs 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析及逆境處理下的表達(dá)Figure 4 Cis-acting element analysis of GuAQPs gene promoters and their expression under stress treatment

2.5 不同處理下6 個(gè)GuAQPs 基因表達(dá)分析

6 個(gè)GuAQPs基因在不同處理下表達(dá)表明(圖5、圖6)，在干旱處理24 h 后GuTIP2;3在葉和根中都顯著上調(diào)表達(dá)(P＜ 0.05)，48 h 只在葉中表達(dá)上調(diào)；在干旱處理7 d 后GuSIP1;4在根和葉中均顯著上調(diào)表達(dá)，而GuPIP2;3只在葉中顯著上調(diào)表達(dá)。

圖5 不同處理下根中GuAQPs 的相對(duì)表達(dá)量Figure 5 Relative expression levels of GuAQPs in roots under different treatments

圖6 不同處理下葉中GuAQPs 的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Relative expression levels of GuAQPs in leaves under different treatments

ABA 處理24 h 后GuSIP1;4和GuTIP2;3在根中顯著上調(diào)表達(dá)(P＜ 0.05)，而在48 h 后GuSIP1;4、GuTIP4;1、GuTIP2;3和GuSIP1;2在葉中顯著上調(diào)表達(dá)；GuPIP2;3在ABA 處理7 d 后葉中顯著表達(dá)。

鹽脅迫處理下24 和48 h 后GuSIP1;4根和葉中都顯著上調(diào)表達(dá)(P＜ 0.05)，GuPIP2;3鹽脅迫處理下24 h 后在根和葉中顯著上調(diào)表達(dá)，而48 h 后只在根中顯著上調(diào)表達(dá)；鹽處理7 d 后GuSIP1;2和GuNIP6;1在葉中顯著上調(diào)表達(dá)，其中GuNIP6;1在根中也顯著上調(diào)表達(dá)；GuTIP2;3在鹽處理24 h 根中顯著上調(diào)表達(dá)，而GuTIP4;1根中的表達(dá)量在鹽處理48 h 和7 d后顯著下調(diào)表達(dá)。

低溫處理下24 和48 h 后在葉中除GuSIP1;4外，其余5 條基因都顯著下調(diào)表達(dá)(P＜ 0.05)；根中GuTIP4;1、GuNIP6;1、GuTIP2;3和GuSIP1;2在48 h和7 d 時(shí)都顯著下調(diào)表達(dá)，而GuSIP1;4在24 h 和7 d時(shí)在根中顯著上調(diào)表達(dá)。

3 討論

AQPs 作為膜蛋白，可促進(jìn)水和其他溶質(zhì)在植物細(xì)胞膜上快速選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，參與植物種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用以及細(xì)胞伸長(zhǎng)等生理過(guò)程[1]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，共鑒定出43 個(gè)GuAQPs基因家族成員，聚類為4 個(gè)亞家族，其中甘草TIPs亞組成員與擬南芥及其他植物TIPs 氨基酸序列平均長(zhǎng)度最短、等電點(diǎn)值相對(duì)較低的特點(diǎn)相似，這可能和TIPs 亞組的C 端較短有關(guān)[25]。AQPs 亞細(xì)胞多定位于細(xì)胞膜，而GuNIP7;1 定位于葉綠體膜，推測(cè)GuNIP7;1 主要參與CO2的轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，與單個(gè)物種的所有AQPs 序列相比，不同物種同一亞組的序列相似性更高，說(shuō)明AQPs 的4 個(gè)亞組在高等植物分化之前就已經(jīng)進(jìn)化形成。有研究表明缺硼條件下AtNIP5;1 在擬南芥對(duì)硼酸的有效攝取中發(fā)揮重要作用[19]，GuNIP5;1 與其有較短的遺傳距離，推測(cè)GuNIP5;1 可能與AtNIP5;1 具有類似的生理功能。NPA 基序、Ar/R 過(guò)濾器及Froger 的5 個(gè)位置是AQPs 最顯著的結(jié)構(gòu)特征，在選擇性運(yùn)輸物質(zhì)的過(guò)程中扮演重要的角色[27]。在本研究中大多數(shù)GuAQPs 均具有雙重典型的NPA 基序，但個(gè)別成員該基序的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基被其他氨基酸替換，推測(cè)不同物種對(duì)底物選擇性具有一定差異。磷酸化能有效調(diào)控蛋白質(zhì)活力和功能，植物AQPs 的磷酸化主要發(fā)生于N 端或C 端的絲氨酸上殘基上[28]，GuAQPs 在絲氨酸殘基處有較多的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明甘草在受脅迫時(shí)絲氨酸磷酸化可能在增強(qiáng)GuAQPs 調(diào)控途徑中更容易起作用。

ABA 是一種內(nèi)源性信號(hào)分子，在調(diào)控蒸騰作用和脫水耐受性等與水分狀態(tài)相關(guān)的過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色[29]。本研究結(jié)果顯示，GuAQPs基因含有眾多激素響應(yīng)元件，尤其是ABA 響應(yīng)元件，而有研究表明干旱脅迫能響應(yīng)ABRE 和MBS 順式作用元件，其參與ABA 介導(dǎo)的滲透脅迫信號(hào)通路[30]，如Zhou 等[31]PEG 處理誘導(dǎo)TaAQP7的上調(diào)表達(dá)可能與內(nèi)源性ABA 信號(hào)通路有關(guān)。除此之外，PEG 處理后水稻OsPIP1;3基因通過(guò)ABA 獨(dú)立的途徑被誘導(dǎo)表達(dá)，在該基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)DRE/CRT 盒，因此該基因上調(diào)表達(dá)可能是由于ABA 作用于DRE/CRT元件的結(jié)果[32]。研究顯示，植物葉片中的AQPs上調(diào)表達(dá)使葉中AQPs 活性增強(qiáng)，其轉(zhuǎn)運(yùn)CO2能力變強(qiáng)，光合底物濃度升高，從而能提高光合速率[33]。本研究中GuTIP2;3分別在干旱和ABA 處理后葉中都上調(diào)表達(dá)，推測(cè)甘草在干旱脅迫下釋放ABA，通過(guò)與AREB 互作，誘導(dǎo)其表達(dá)，進(jìn)而在葉片光合作用中發(fā)揮作用。鹽脅迫是水脅迫和離子脅迫的疊加，鉀作為最豐富的細(xì)胞陽(yáng)離子，在維持細(xì)胞膨壓和膜電位中起著關(guān)鍵作用，因此植物在遭受Na+脅迫時(shí)，鈉鉀離子吸收系統(tǒng)便遭到破壞，導(dǎo)致液泡水分流失，從而使植物生長(zhǎng)受到抑制[34]。有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥TIP2;2的缺失使得離子泄漏，導(dǎo)致其對(duì)非生物脅迫的敏感性較低[35]；Gao 等[36]在擬南芥中過(guò)表達(dá)TaNIP提高了K+/Na+，進(jìn)而維持轉(zhuǎn)基因植株低Na+、高K+的離子狀態(tài)，從而可以提高耐鹽性，說(shuō)明AQPs 可以通過(guò)參與改善離子分布以及維持滲透平衡來(lái)提高植物對(duì)脅迫條件的抗性[37]。GuPIP2;3、GuSIP1;4、GuNIP6;1及GuTIP2;3等在鹽脅迫處理后在根中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)甘草根可能通過(guò)調(diào)節(jié)這4 個(gè)基因的表達(dá)影響離子穩(wěn)定系統(tǒng)，進(jìn)而改變?nèi)苜|(zhì)濃度來(lái)調(diào)控細(xì)胞含水量用以抵御鹽脅迫。有研究表明，AQPs中PIPs和TIPs亞家族基因在高鹽分脅迫中起主導(dǎo)作用[38]，而本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示鹽脅迫處理后甘草地上部分上調(diào)表達(dá)的基因中PIPs 亞家族占多數(shù)，說(shuō)明甘草PIPs 亞家族基因可能對(duì)響應(yīng)鹽脅迫也有類似的作用。

溫度是影響植物根系生理功能的重要因素之一，低溫會(huì)降低根系對(duì)水分的吸收，導(dǎo)致地上部分水分虧缺[39]。有研究表明小麥(Triticum aestivum)TaAQP7[31]和水稻OsPIP2;7[40]等在低溫處理后被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，這些上調(diào)的AQPs基因?qū)涞姆磻?yīng)可能是由細(xì)胞水運(yùn)動(dòng)所驅(qū)動(dòng)，在參與水的快速運(yùn)輸和維持細(xì)胞內(nèi)的水平衡中發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)對(duì)低溫的耐受性[34]。Narusaka 等[41]在擬南芥rd29A的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)LTRE 元件，闡明其在調(diào)控低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用；Deokar 和Tar’an[42]發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆(Cicer arietinum)在低溫處理下CaTIP1-1、CaTIP4-2及CaPIP2-3的高表 達(dá)與啟動(dòng)子序列含有LTR 元件有關(guān)，在本研究中GuSIP1;4經(jīng)低溫處理后其在根中的表達(dá)量顯著上升，這可能與GuSIP1;4基因含有多個(gè)低溫響應(yīng)元件有關(guān)，說(shuō)明AQPs 可能通過(guò)提高水分運(yùn)輸，調(diào)節(jié)根系導(dǎo)水率，從而幫助甘草抵御冷害。

水通道蛋白作為重要的膜功能性蛋白，近年來(lái)對(duì)其的研究也備受關(guān)注，隨著越來(lái)越多植物AQPs被分離鑒定，其功能和作用也較為廣泛深入地被發(fā)現(xiàn)。研究表明，植物AQPs 在根和葉的水力調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其在植物組織生長(zhǎng)，種子萌發(fā)以及花粉發(fā)育和授粉等生理和發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被證實(shí)[3]。不僅如此，AQPs 還通過(guò)滲透勢(shì)梯度介導(dǎo)水跨膜的運(yùn)輸參與植物對(duì)各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)，如干旱、澇害、鹽度和重金屬及養(yǎng)分虧缺等[43]。植物通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)、四聚化、pH、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、植物激素和其他化學(xué)物質(zhì)等不同機(jī)制調(diào)節(jié)AQPs，以維持其體內(nèi)水分的吸收和運(yùn)輸，進(jìn)而使得植物能在不同環(huán)境下正常生長(zhǎng)[44]。目前，隨著全球環(huán)境條件不斷惡化，尤其是干旱和土壤鹽堿化的加劇，使得甘草的種植和生產(chǎn)面臨困難，因此，對(duì)于解析GuAQPs 控制水分平衡的機(jī)理還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)和qRT-PCR的方法對(duì)甘草AQPs基因家族進(jìn)行分析，qRT-PCR結(jié)果表明GuTIP2;3基因在葉中能顯著響應(yīng)干旱和ABA 處理，甘草根在鹽脅迫下GuPIP2;3、GuSIP1;4、GuNIP6;1和GuTIP2;3都被誘導(dǎo)表達(dá)，其可能對(duì)甘草所受鹽脅迫有緩解作用。此外GuSIP1;4在低溫下表達(dá)量上升，推測(cè)其可能對(duì)甘草抵御寒害起一定作用。因此，GuAQPs在遭受非生物脅迫時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)自身表達(dá)情況來(lái)應(yīng)對(duì)干旱、鹽以及冷害等環(huán)境脅迫。本研究結(jié)果為后續(xù)研究甘草AQPs基因的功能、更深入闡述甘草AQPs 維持水分平衡的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。