李 鋒，冷 拓，唐麗君，甘 蓓，陳 奕*

(1.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031;2.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330001;3.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院，江西 南昌 330052)

牛肉是世界上食用最廣泛的肉類之一。與其他肉類相比，牛肉豐富的蛋白質(zhì)和較少的脂肪為日常生活提供了良好的營(yíng)養(yǎng)[1]。此外，目前世界上大部分的肉類供應(yīng)來自豬肉(36%)、家禽(35%)、牛肉(22%)和其他動(dòng)物(7%)。美國(guó)、巴西和中國(guó)是世界上牛肉消費(fèi)量前三位的國(guó)家。由于其受到消費(fèi)者的歡迎，牛肉價(jià)格相對(duì)較高，因此產(chǎn)生了巨大的利潤(rùn)。一些不良商人總是在牛肉中摻入價(jià)格較低的物質(zhì)[2]，比如用豬肉腌制上色后冒充牛肉，一些用肉眼很難分辨的干制品，例如牛肉干等產(chǎn)品也是由其他較廉價(jià)的肉摻和制成的，在冬季，火鍋成了中國(guó)人的最愛，而一些不道德商家用廉價(jià)的肉添加牛肉香精制成假的牛肉丸在火鍋店里銷售。肉類摻假會(huì)嚴(yán)重影響消費(fèi)者的利益，也會(huì)引發(fā)一些與公共衛(wèi)生和宗教有關(guān)的問題(例如，清真食品中沒有豬肉，印度教飲食中沒有牛肉)。一些肉類質(zhì)量問題已引起廣泛關(guān)注。例如，幾年前發(fā)生在歐洲的馬肉丑聞成為全球肉類摻假的經(jīng)典案例，引發(fā)了大規(guī)模的公眾信任危機(jī)。因此，隨著經(jīng)濟(jì)全球化的推進(jìn)，肉類及肉制品摻假的檢測(cè)變得越來越重要。

近年來，檢測(cè)肉類摻假的方法有很多，主要有色譜技術(shù)、電子鼻技術(shù)，熱學(xué)技術(shù)和基于DNA的技術(shù)。但是這些方法存在一些缺點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果取決于操作人員的技術(shù)水平與熟練程度，同時(shí)存在分析時(shí)間長(zhǎng)、分析過程復(fù)雜、對(duì)樣品有不同程度破壞等弊端[3]。因此，迫切需要開發(fā)新的、快速的、無損和準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)肉類摻假。

近紅外光譜技術(shù)具有快速、靈敏、樣品制備量少的優(yōu)點(diǎn)，能夠用定性和定量信息提供完整的化學(xué)成分信息[4]。在以前的研究中，近紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合被證明是檢測(cè)肉類摻假最有效的技術(shù)之一。例如，NohaMorsy等[5]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合線性判別分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)對(duì)摻入豬肉、魚油的新鮮牛肉樣品進(jìn)行分類。同年，Cristina Alamprese等[6]使用NIR(942-2667 nm)光譜對(duì)摻有火雞的牛肉碎末進(jìn)行了研究，并獲得了最佳分類率。同樣Mohammed Kamruzzaman等[7]研究了近紅外高光譜成像檢測(cè)牛肉碎肉中馬肉的可行性。次年，他們還研究了近紅外高光譜成像技術(shù)檢測(cè)牛肉碎肉中的雞肉摻假。先前的研究證明，近紅外光譜法與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)相結(jié)合可對(duì)肉進(jìn)行摻假檢測(cè)。但是，關(guān)于如何快速無損且靈敏度高地對(duì)牛肉摻假進(jìn)行定性和定量分析的信息仍然有限。本研究的目的是以牛肉糜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過NIR結(jié)合判別分析(DA)和主成分回歸(PCR)來建立一種簡(jiǎn)單、快速、無損、靈敏度高的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)假牛肉定性和定量的分析，為了提高DA和PCR模型的性能，比較了不同的預(yù)處理方法，并在模型構(gòu)建過程中對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

所有豬肉，牛肉的新鮮樣品(包括腿肉和胸肉)均購(gòu)自中國(guó)江西省南昌市的當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。為了提高肉類的代表性，在不同的商店和市場(chǎng)上收集了不同批次的新鮮樣品(包括六批次的豬肉，牛肉)。首先將樣品修剪以去除可能干擾分析的成分(例如脂肪)，然后用刀將其切成小塊，最后用絞肉機(jī)(30s)分別切開以使其均勻。對(duì)該摻假模型(牛肉摻入豬肉)隨機(jī)選擇三批不同的豬肉和牛肉來制備摻假樣品。將不同比例(10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%和 80%)的牛肉摻入豬肉中，總共獲得72個(gè)(3×3×8，即3種牛肉與3種豬肉互配的8種比例)混合樣品，其次還包括純牛肉和純豬肉，總共獲得了 78 個(gè)樣品。在進(jìn)一步分析之前，所有這些樣品都儲(chǔ)存在4 ℃下。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Nicolet 5700 FT-IR 光譜儀(美國(guó) Thermo Scientific)；JYL-CO12絞肉機(jī)(中國(guó)九陽(yáng)有限公司)；ME104E型電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；DHG-9246A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；TQ Analyst Pro Edition(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 光譜采集

使用BaselineTM漫反射附件，氟化鈣分束器和InGaAs 檢測(cè)器在光譜儀上收集NIR光譜。每個(gè)樣品取2g轉(zhuǎn)移到石英瓶中進(jìn)行測(cè)試。光譜在12 500～5400 cm-1范圍內(nèi)獲得，平均掃描64次，分辨率為16 cm-1。在每次樣品測(cè)量之前，使用相同的儀器條件掃描背景去離子水光譜[8]。每種樣品約2 g分別填充在石英瓶中(直徑1.2 mm，壁厚2.0 mm)并緊密包裝，光譜收集一式3份。3個(gè)光譜的平均值用于進(jìn)一步分析。所有光譜記錄為log(1/R)，其中R是相對(duì)反射率。

1.4 光譜預(yù)處理

所有光譜均采用TQ analyst 8.6.12[9]進(jìn)行處理。為了提高模型的精度，通常采用光譜預(yù)處理的方法來減少光散射或系統(tǒng)噪聲的干擾。近紅外光譜預(yù)處理方法主要包括：光譜歸一化和光譜導(dǎo)數(shù)[10]。

1.4.1 分類分析

DA是一種統(tǒng)計(jì)分析方法，用于在樣本多元統(tǒng)計(jì)量中區(qū)分樣本類型。這是一種多變量分析技術(shù)，當(dāng)通過某種方法將已知的研究對(duì)象劃分為幾個(gè)類別時(shí)，它可以確定新樣品屬于哪個(gè)類別。

在該項(xiàng)研究中，通過計(jì)算新樣本與已知群體之間的距離，使用DA判別分析方法對(duì)純?nèi)夂蛽郊偃膺M(jìn)行了分類。

1.4.2 定量分析

在本文中，使用PCR模型對(duì)牛肉中的豬肉進(jìn)行了定量分析。PCR是指回歸分析的一種,當(dāng)自變量存在復(fù)共線性剛，用于改進(jìn)最小二乘回歸的統(tǒng)計(jì)分析方法。通過線性變換，將原來的多個(gè)指標(biāo)組合成相互獨(dú)立的少數(shù)幾個(gè)能充分反映總體信息的指標(biāo)，從而在不丟掉重要信息的前提下避開變量間共線性問題，便于進(jìn)一步分析。在主成分分析中提取出的每個(gè)主成分都是原來多個(gè)指標(biāo)的線性組合。

1.4.3 模型的性能評(píng)估

將所有樣品隨機(jī)分為兩個(gè)子集。3/4的樣本構(gòu)成了用于構(gòu)建模型的校準(zhǔn)集，其余的則用作測(cè)試模型的魯棒性預(yù)測(cè)集。對(duì)于DA模型，通過計(jì)算正確分類(%CC)樣本的百分比來評(píng)估 DA 模型性能。建立的用于預(yù)測(cè)的 PCR 模型的性能是基于Rp和Rc因子，RMSEP 和 RMSEC 等指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 NIR光譜

純?nèi)夂蛽郊偃獾腘IR光譜圖如圖1所示。在波數(shù)為10 200，9 600，8 300，6 900和6 000～5 700 cm-1附近出現(xiàn)了峰。10 200和6 900 cm-1附近的光譜峰與水中的O-H伸縮振動(dòng)有關(guān)[11]。9 600，8 300和6 000～5 700附近的光譜區(qū)域分別與脂質(zhì)C-H的伸縮和彎曲振動(dòng)相關(guān)。蛋白質(zhì)的主要吸收帶(C-N伸縮組合，N-H平面內(nèi)彎曲和C-O伸縮振動(dòng)；C=O伸縮和C-H伸縮的組合；N-H彎曲振動(dòng))是在4 653～4 527cm-1之間?？梢钥吹?，所有光譜的峰輪廓相似，但峰強(qiáng)度不同。牛肉的吸收峰在8 300 cm-1附近，但是隨著豬肉的加入，其吸收強(qiáng)度下降。另外，在牛肉中觀察到在6 000～5 700附近有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，而豬肉、牛肉-豬肉的吸收峰吸收較弱。由于NIR光譜中的峰重疊，很難僅依靠NIR光譜來量化所有差異。因此，有必要使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法從近紅外光譜中進(jìn)一步全面挖掘出有效的差異信息。

λ/cm-1圖1 牛肉、豬肉和牛肉-豬肉混合樣品的近紅外光譜Fig.1 Near infrared spectroscopy of beef,pork and beef pork mixed samples

2.2 DA結(jié)果

2.2.1 基于全波長(zhǎng)的判別結(jié)果

在這項(xiàng)研究中，變量標(biāo)準(zhǔn)化(Standard Normal Variate，SNV)，多元散射校正(Multiple Scatter Correlation，MSC)和卷積平滑算法(Savitzky-Golay，S-G)作為預(yù)處理方法。SNV是校正標(biāo)度和基線效應(yīng)的有效方法之一，主要用來消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對(duì)漫反射光譜的影響，MSC作用與SNV類似，主要用于消除由于顆粒分布和粒徑不均勻而引起的散射現(xiàn)象[12]。對(duì)于光譜導(dǎo)數(shù)法，在數(shù)據(jù)采集過程中，由于背景色以及其他因素引起的誤差不能減小到零，但光譜導(dǎo)數(shù)算法可以做到消除基線漂移以及背景柔和引起的干擾，進(jìn)而區(qū)分出重疊峰，提高了模型的分辨率和靈敏度。然而目前最常使用的推導(dǎo)算法是S-G濾波方法，在基于時(shí)域多項(xiàng)式的前提下使用最小二乘法通過移動(dòng)窗口進(jìn)行最接近擬合。通過選擇不同的多項(xiàng)式和次數(shù)，選擇了性能更高的產(chǎn)量模型。S-G濾波器在數(shù)據(jù)流平滑和降噪方面有廣泛的運(yùn)用。

對(duì)于該摻假體系，表1顯示了DA使用不同的預(yù)處理技術(shù)建立的模型鑒別能力?？梢杂^察到，在不使用任何預(yù)處理方法或使用S-G的情況下對(duì)模型進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，鑒別率可以達(dá)到100%。但是，采用其他預(yù)處理方法的模型的分類結(jié)效果很差，因?yàn)橐恍┯杏玫男畔⒖赡軙?huì)在預(yù)處理過程中隨著噪聲或散射效應(yīng)而從光譜中刪除。圖2顯示了基于全波長(zhǎng)原始光譜的DA模型鑒別牛肉摻假效果。從該圖中可出看出，摻假樣本(正方形)集中分布在坐標(biāo)軸左上方，且隨著摻假比例的增加，摻假樣本越靠近豬肉，純豬肉(圓形)分布在中間，純牛肉分布在右下方。

表1 基于全波長(zhǎng)和選擇波長(zhǎng)的近紅外光譜得到二元體系的DA結(jié)果Tab.1 DA results of binary system were obtained based on the near infrared spectra of full wavelength and selective wavelength

圖2 基于全波長(zhǎng)原始光譜的DA模型鑒別牛肉糜摻假效果Fig.2 Identification of adulterated beef by DA model based on full wavelength original spectrum

因此可以得出結(jié)論，對(duì)于牛肉的摻假，均使用SG作為預(yù)處理方法獲得了最佳模型。針對(duì)先前研究產(chǎn)生的摻假牛肉糜，DA模型顯示出比NIR模型更好的性能。

2.2.2 基于選擇波長(zhǎng)的判別結(jié)果

使用全光譜結(jié)構(gòu)建立的DA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)顯示了近紅外光譜技術(shù)預(yù)測(cè)牛肉中豬肉的潛力。然而，基于整個(gè)光譜的回歸模型可能包含非必要信息(噪聲，共線性和過度擬合)，有時(shí)準(zhǔn)確性不如預(yù)測(cè)變量少的模型[13]。為了減少數(shù)據(jù)處理時(shí)間，并使之適用于實(shí)際的在線系統(tǒng)，必須進(jìn)行必要波長(zhǎng)的選擇。如圖1所示，在10 600 cm-1之后的波長(zhǎng)中存在明顯的噪聲，因此本文僅選擇的波長(zhǎng)為10 600～5 400 cm-1，并將其用于建立數(shù)學(xué)模型。

對(duì)于該摻假體系，基于波長(zhǎng)選擇后的DA模型的結(jié)果如表1所示。與全波長(zhǎng)模型相比，選擇波長(zhǎng)較少的簡(jiǎn)化模型顯示了更好的分類結(jié)果以及更佳的校準(zhǔn)和驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)參數(shù)。消除噪聲的同時(shí)也一并消除了冗余的可變波長(zhǎng)。個(gè)別而言，預(yù)處理方法與原始數(shù)據(jù)相比，分類率沒有改善。與全波長(zhǎng)模型相同，在簡(jiǎn)化模型中，利用原始光譜或S-G預(yù)處理光譜建立的模型仍然是最好的，分類率達(dá)到100%。然而用于執(zhí)行簡(jiǎn)化模型的變量數(shù)量減少了。因此，基于全波長(zhǎng)原始光譜的模型不如由有效波長(zhǎng)建立的模型好，且分類率低于有效波長(zhǎng)的模型，表明該模型的識(shí)別能力不如有效波長(zhǎng)下模型的識(shí)別能力。

在本研究中，針對(duì)已有結(jié)果可知用選定波長(zhǎng)的原始光譜建立的DA模型可以作為系統(tǒng)中區(qū)分摻假牛肉的首選方法。

2.3 PCR處理結(jié)果

2.3.1 基于全波長(zhǎng)的摻假水平預(yù)測(cè)

對(duì)于用豬肉摻假的牛肉，使用PCR模型預(yù)測(cè)了摻假水平?；诓煌庾V預(yù)處理的全光譜模型的性能如表2所示。對(duì)于主成分分析法，為了避免建立的校準(zhǔn)模型過度擬合或擬合不足，在校準(zhǔn)模型的遺漏交叉驗(yàn)證過程中，使用最小均方根誤差來確定因子的數(shù)量。如表2所示，對(duì)原始光譜的全波長(zhǎng)進(jìn)行擬合，得到了最佳的PCR模型，顯示了出色的預(yù)測(cè)性能(Rc=90.30%，Rp=92.21%，RMSEC= 11.2和RMSEP=9.80)。本文獲得的結(jié)果略低于先前的研究結(jié)果[14](Rc2=97%，Rv2=96%，RMSEC=0.15，RMSEP=0.24)。圖3中顯示了二元摻假體系中真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的關(guān)系，以圖形方式更直觀地顯示了模型的魯棒性。因此得出結(jié)論基于全波長(zhǎng)的無預(yù)處理方法獲得了最佳的預(yù)測(cè)模型。

表2 不同預(yù)處理技術(shù)和波長(zhǎng)篩選對(duì)PCR模型的影響Tab.2 Effects of different pretreatment techniques and wavelength screening on PCR model

圖3 基于NONE處理(即未處理的原始光譜)的PCR模型散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of PCR model based on none processing

2.3.2 基于所選波長(zhǎng)的摻假水平預(yù)測(cè)

對(duì)于本研究，表2顯示出了使用波長(zhǎng)篩選后構(gòu)建的PCR模型的結(jié)果，相比之下，基于NONE技術(shù)的模型是最好的，具有最高的校準(zhǔn)和預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(Rc=86.24%，Rp=91.26%)以及較小的RMSEC和RMSEP值。此外，與全波長(zhǎng)模型相比，簡(jiǎn)化后的PCR模型，其結(jié)果不佳，因?yàn)橛邢鄬?duì)較高的RMSEP(13.1 vs.11.2)和較低的Rc(86.41% vs 90.30%)。造成這個(gè)結(jié)果可能是因?yàn)槿コ牟ㄩL(zhǎng)含有對(duì)建立PCR模型有用的信息。因此可以得出結(jié)論，基于全波長(zhǎng)而不是原始光譜的選擇性波長(zhǎng)的模型的預(yù)測(cè)能力是預(yù)測(cè)牛肉中豬肉摻假水平的有用工具。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(包括DA和PCR)對(duì)牛肉與豬肉的摻假進(jìn)行定性和定量表征是可行的。分類和定量模型的性能可能會(huì)受到光譜預(yù)處理和波長(zhǎng)范圍的影響。結(jié)果表明，利用選定重要波長(zhǎng)(cm-1)的原始光譜建立的DA模型可以對(duì)牛肉，豬肉和摻假牛肉進(jìn)行識(shí)別和分類，對(duì)該摻假系統(tǒng)來說，其準(zhǔn)確度為100%。此外，使用全波長(zhǎng)原始光譜執(zhí)行的PCR模型具有出色的預(yù)測(cè)能力，可預(yù)測(cè)牛肉樣品中豬肉的摻假水平。當(dāng)前的研究成功地證明了NIR作為一種無損分析方法[15]，可以被視為肉末產(chǎn)品摻假檢測(cè)的傳統(tǒng)方法的快速且高度可靠的替代方法。然而，需要作出更大的努力來提高檢測(cè)牛肉摻假物的準(zhǔn)確性。